各型急性白血病，特别是急性淋巴细胞白血病；恶性淋巴瘤的非何杰金淋巴瘤和蕈样肉芽肿；多发性骨髓瘤；
恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌；
头颈部癌、支气管肺癌、各种软组织肉瘤；
高剂量用于骨肉瘤，鞘内注射可用于预防和治疗脑膜白血病以及恶性淋巴瘤的神经侵犯，本品对银屑病也有一定疗效。
本品用注射用水2毫升溶解，可供静脉、肌内、动脉、鞘内注射；
用于急性白血病：肌肉或静脉注射，每次10～30mg，每周1～2次。儿童每日20～30/m2，每周一次，或视骨髓情况而定。
用于绒毛膜上皮癌或恶性葡萄胎：每日10～20mg，亦可溶于5%或10%的葡萄糖注射液500ml中静脉滴注，一日1次，5～10次为一疗程，总量80mg～100mg。
用于脑膜白血病：鞘内注射甲氨蝶呤每次一般6mg/m2，成人常用于5～12mg，最大不＞12mg，一日1次，5天为一疗程。用于预防脑膜白血病时，每日10～15mg，一日1次，每隔6～8周一次。
用于实体瘤：
静脉一般20mg/m2/次。
亦可介入治疗。
高剂量并叶酸治疗某些肿瘤，方案根据肿瘤由医师判定，如骨肉瘤等。
胃肠道反应：包括口腔炎、口唇溃疡、咽喉炎、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、消化道出血。食欲减退常见，偶见伪膜性或出血性肠炎等；
肝功能损害：包括黄疸、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶等增高，
大剂量应用时，由于本品和其它代谢产物沉积在肾小管而致高尿酸血症性肾病，此时可出现血尿、蛋白尿、尿少、氮质血症甚或尿毒症；
长期用药可引起咳嗽、气短、肺炎或肺纤维化；
骨髓抑制：主要引起白细胞和血小板减少，尤以应用大剂量或长期口服小剂量后，引起明显骨髓抑制，贫血和血小板下降而致皮肤或内脏出血；
脱发、皮肤发红、瘙痒或皮疹，后者有时为对本品的过敏反应；
在白细胞低下时可并发感染；
鞘内注射后可能出现视力模糊、眩晕、头痛、意识障碍，甚至嗜睡或抽搐等。
本品的致突变性，致畸性和致癌性较烷化剂为轻，但长期服用后，有潜在的导致继发性肿瘤的危险；
对生殖功能的影响，虽也较烷化剂类抗癌药为小，但确可导致闭经和精子减少或缺乏，尤其是长期应用较大剂量后。但一般多不严重，有时呈不可逆性；
周围血象如白细胞低于3500/mm3或血小板低于50000/mm3时不宜用本品。
有肾病史或发现肾功能异常时，禁用大剂量甲氨蝶呤疗法，未准备好解救药四氢叶酸钙（CF），未充分进行液体补充和碱化尿液时，也不能用大剂量甲氨蝶呤疗法。
大剂量甲氨蝶呤疗法易致严重副反应，须经住院并有可能随时监测其血药浓度时才能谨慎使用。滴注时不宜超过6小时，太慢易增加肾毒性；大剂量注射本品2～6小时后，可肌内注射甲酰四氢叶酸钙3～6mg，每6小时1次，注射1～4次，可减轻或预防副作用。
乙醇和其他对肝脏有损害药物，如与本品同用，可增加对肝脏的毒性；
由于用本品后可引起血液中尿酸增多，在痛风或高尿酸血症患者应相应增加别嘌醇等药剂量；
本品可增加抗血凝作用，甚至引起肝脏凝血因子的缺少或（和）血小板减少症，因此与其他抗凝药同用时宜谨慎；
与保泰松和磺胺类药物同用时，因与蛋白质结合的竞争，可能会引起本品血清浓度的增高而导致毒性反应的出现；
口服卡那霉素可增加口服本品的吸收，而口服新霉素可减少其吸收。
与弱有机酸和水杨酸盐等同用，可抑制本品的肾排泄而导致血清药浓度增多，因此应酌情减少用量；
氨苯蝶啶、乙胺嘧啶等药物均有抗叶酸作用，如与本品同用可增加其毒副作用；
与氟尿嘧啶同用，或先用氟尿嘧啶后用本品，均可产生拮抗作用，但如先用本品，4～6小时后再用氟尿嘧啶则可产生协同作用，同样本品如与左旋门冬酰胺酶合用时也可导致减效，如用后者10日后或于本品用药后24小时内给左旋门冬酰胺酶，则可增效而减少对胃肠道和骨髓的毒副作用；有报道如在用本品前24小时或10分钟后用阿糖胞苷，可增加本品的抗癌活性。本品与放疗或其他骨髓抑制药同用时宜谨慎。
