分离及克隆组织不同发育阶段差异表达基因，对于了解组织的发育、分化及其相关疾病的发病机理及疾病的演化过程均具有重要意义。胆管癌是近年来引起重视的肝胆管系统肿瘤，其发病率在我国较高，从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程，对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义。基于临床研究［1］的结果，我们采用liang p［2］1992年建立的差异显示法(ddrt-pcr)，来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cdna。该方法具有高效、灵敏的优点，已经多次改进并广泛应用于许多疾病及肿瘤的研究中。目前已成为分子生物学研究的一个重要方法。近年来，ddrt-pcr法已有很大改进，根据我们实验设计的要求，在建立该方法的同时，对其实验流程及技术条件进行了探索、优化及改进。
1 材料与方法
1.1 组织来源
胆管癌组织取自解放军总医院肝胆外科临床手术标本，所有标本离体后立即置于液氮中，后转入-80℃保存，同时取部分组织送病理科检查，以决定病理分型及分化等级。引物：锚定引物3条，分别是t15a、t15g、t15c；随机引物11条。所有引物均为军科院生物工程研究所张京生合成。
1.2 总rna的提取及单链cdna的合成
采用gbicol公司的trizol总rna提取试剂盒。分别从高分化、低分化胆管癌组织中提取总rna，测od260、od280值。逆转录单链cdna的合成：每个样品分三管进行逆转录，反应体积为20μl，每管分别加入：1 μg总rna、5 μmol/l t15m、0.5 mmol/l 4dntps、20 u rnasin、100 u mmlv reverse transcriptase(premega公司)。70℃温育5 min，95℃变性5 min，置-20℃保存。
1.3 ddrt-pcr
在20 μl体系中对2 μl逆转录产物进行扩增，2 μmol/l 4dntps，5 μmol/l锚定引物t15m，1 μmol/l随机引物，1 μci α-32p-dctp，1.5 u taq酶。pcr循环参数：94℃，3 min→(94℃，30 s→38℃，30 s→68℃，1 min)×2 cycles→(94℃,20 s→48℃,30 s→68℃,40 s)×28 cycles→68℃,5 min→4℃。
1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影
dd-pcr产物取6 μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定功率50w，电泳约3 h，直至二甲苯氰接近凝胶底部，滤纸揭胶，覆保鲜膜后压x光片，-70℃曝光14 h，显影。
1.5 差异片段的切取及再扩增
电泳后压片时就要定好位，显影后将x片重新复位，确定感兴趣的差异片段的位置，用无菌刀片切胶，将切下的凝胶及滤纸一起浸入100 μl去离子水中10 min，煮沸15 min，离心后上清移入一新管，加入10 μl 3mol/l naoac、5 μl(10 mg/ml)糖元和450 μl 100%乙醇，混匀，-80℃放置30 min，4℃离心10 min，弃上清，75%乙醇洗涤沉淀一次，凉干后溶于10 μl去离子水中，-20℃保存。再扩增时，使用同样的引物组和pcr条件，只是提高4dntps的浓度为2 mmol/l，无需同位素，pcr循环条件：94℃，3 min→(94℃，30 s→40℃,60 s→72℃,40 s)×35 cycles→72℃,5 min→4℃。
1.6 反向northern blot鉴定
以混合纤维素膜作为支持物，先进行印迹，用多孔抽滤加样器，将再扩增物分别点样后，用化学变性及热变性法交联，80℃烤2 h后，室温保存。标记探针基本上按照文献［4］进行。常规方法68℃杂交12 h，中等强度洗膜后放射自显影，-80℃压片22 h，显影。
1.7 直接测序
pcr产物经纯化后可直接用来测序，测序引物用t15n，但有些pcr产物可能混杂了其它条带，直接测序无法获得好的结果，则可将其克隆到质粒载体上，再进行测序。
1.8 pcr产物的克隆与转化
用jm109大肠杆菌感受态，用premega公司pgem-t vector system i kit克隆pcr产物，按试剂盒说明书进行连接和转化，蓝白斑筛选菌落，并进行pcr鉴定。
1.9 质粒的提取与测序
选取经鉴定证实的阳性重组子的细菌培养物，按照qiagen公司的qiaprep spin miniprep kit说明书提取重组的质粒。pcr产物的核苷酸序列分析采用全自动dna序列分析仪及配套的abi试剂，采用taq dna聚合酶及荧光标记的通用引物。
1.10 同源序列比较及序列分析
通过internet，从blast(blast of local alignment search tool)及est(expressed sequence tags)基因数据库中查询cdna片断的同源序列。
2 结果与讨论
2.1 ddrt-pcr
高、低分化胆管癌组织标本的总rna分别用3条锚定引物逆转录，然后再分别与12条随机引物相互配对进行pcr反应。在pcr反应中掺入同位素α-32p-dctp均能显示出高、低分化胆管癌间的差异条带。实验经多次证明，反应重复性好。
2.2 差异条带的回收
根据放射自显影结果，差异条带可分为两组：①高分化胆管癌组织表达，而低分化组织不表达的，命名为hg；②低分化胆管癌组织表达，而高分化组织不表达的，命名为lg。共分离并回收32条差异条带。
2.3 反向northern blot鉴定
分别用同位素标记高、低分化胆管癌组织标本总rna，做成探针与点到膜上的32个差异条带的pcr扩增产物进行杂交，经过再次鉴定，共有9个片段是真正有差异的，其中hg 3条，lg 6条。
2.4 pcr产物直接测序
有两个pcr产物经纯化后直接测序，测序结果还是可信的。其中一个序列是与laminin receptor(lr)高度同源(96%)，而另一个序列是与est中的大量序列高度同源(98%)。
2.5 pcr产物的克隆与序列分析
将上述不宜直接测序的pcr产物进行扩增、纯化，克隆到质粒载体上，进行测序。测得的序列通过internet，从blast及est数据库查询该序列的同源序列。
3 结论
目前，人类基因组计划(hgp)已进入功能基因组研究阶段，而作为功能的主要标志就是表型，而疾病状态及发病过程则是最显著的表型，开展疾病相关基因的克隆、鉴定和功能研究，可使功能基因组学在实质内容上得到具体体现。临床上，主要通过大体外观或组织学对肿瘤进行分级和分类，此种划分有许多局限性。如：临床上常常可见组织病理学相似的肿瘤却有着明显不同的临床过程和表现，且其药物治疗作用及预后亦不同。临床研究［1］发现：分化程度，对于胆管癌是一个重要的预后影响因素。在分子水平上对分化的研究将有助于对正常分化及肿瘤分化的深入了解。利用ddrt-pcr技术，从mrna或总rna着手，利用pcr扩增和凝胶电泳技术，快速、高效地分析两个或多个组织或细胞系mrna的表达情况，从中找出差异表达的基因片段，然后与基因克隆、鉴定等配套技术结合再进行全长基因的克隆、鉴定及功能研究。该技术已在许多专业及领域应用，特别是在肿瘤学研究方面应用广泛。由于其简便、特异、敏感、重复性好等特点，目前已成为分子生物学研究的一个重要方法。本课题组成功建立了ddrt-pcr方法，并在原方法基础上有所改进［3］，采用该技术分析手术切除的不同分化胆管癌组织基因表达的差异，筛选出一些与胆管癌分化相关的基因片段。
细胞分化是一个复杂的、多因素参与调控的、多步骤的生理过程［5］，表现出异常分化特征的肿瘤常常会表现出异常的生长特征及远处侵袭和转移的性质，因此一般认为分化缺陷可能是肿瘤细胞恶性潜能的重要决定因素。本研究表明：许多基因参与调节胆管瘤细胞生长、分化的病理过程，如：lr等。对这些基因的进一步研究将有助于揭示不同分化程度胆管癌的病理机制、胆管癌的早期诊断及基因治疗。
参考文献：
［1］ 周宁新，王大东.胆管癌的病理学特征对手术后远期效果的影响［j］.中国普通外科杂志，1998，7(4)：216-219
［2］ liang p, pardee ab. differential display of eukaryotic messenger rna by means of the polymerae chain reaction［j］. science,1992,257:967-971
［3］ 周宁新，张效东，卢柏松，等.差异显示技术的应用和改进［j］.军医进修学院学报，2000，21(3)：168-171
［4］ wadhwa r, duncan e, kaul sc, et al. an effective elimination of false positives isolated from differential display of mrnas［j］. mol biotech,1996,6:213-217
［5］ scott, re. differentiation, differentiation/gene therapy and cancer pharmacol［j］. ther,1997,73:51-65
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