银屑病患者表皮及真皮中Bcl-X、Bcl-2、Bax表达的免疫组化研究

2015-09-30 17:19:54

　　银屑病患者表皮及真皮中bcl-x、bcl-2、bax表达的免疫组化研究

　　中华皮肤科杂志 1999年第6期第32卷论著

　　作者：茅晓红　程浩　孙国均　张家敬　周凯

　　单位：310009杭州，浙江医科大学附属第二医院皮肤科

　　关键词：银屑病细胞死亡bcl-xbcl-2bax

　　【摘要】目的　探讨银屑病患者细胞增殖与凋亡的调节。方法　用免疫组化sp法检测银屑病皮损及非皮损中bcl-x、bcl-2、bax的表达情况。结果　银屑病皮损中，bcl-x在表皮各层、真皮炎症细胞及血管内皮的表达均较正常明显增高；bax在颗粒层与棘层的表达轻度增高。上述异常在非皮损中已经部分存在，且治疗后未完全恢复正常。而bcl-2表达与正常相似，局限于基底层黑素细胞，角质形成细胞未见阳性。结论　银屑病中角质形成细胞过度增殖，炎症细胞浸润及血管增生可能与bcl-x/bax比率的上调有关。bcl-2对银屑病的发病可能意义不大。

　　immunohistochemical study of epidermal

　　and dermal expression of bcl-x,bcl-2

　　and bax in psoriasis

　　mao xiaohong,cheng hao,sun guojun,et al.

　　department of dermatology, second affiliated hospital,

　　zhejiang medical university, hangzhou 310009

　　【 abstract】 objective　to investigate the regulation of cell proliferation and apoptosis in psoriasis.methods the expressions of bcl-x, bcl-2 and bax were studied with immunohistochemical technique(sp) in the lesional and non-lesional psoriatic skin.results there were significant overexpressions of bc-x in all layers of epidermis, inflammatory cells and vascular endothelia in dermis; there were mild up-regulations of bax expression in stratum granulosum and stratum spinosum in the lesional skin. those abnormalities had already been observed in part of non-lesional skin and not returned to normal after treatment. however, the expression of bcl-2 was as normal, restricted only to melanocytes in the basal layer; and no bcl-2 expression was found in keratinocytes.conclusion the up-regulated ratio of bcl-x to bax probably contributes to the overproliferation of keratinocytes, intensive infiltration of inflammatory cells and hyperplasia of new vessels. bcl-2 may be less important for the initiation of psoriasis.

　　【 key words】 psoriasis apoptosis bcl-x bcl-2 bax

　　银屑病是一种多基因控制的良性增生性炎症性疾病。目前已发现其皮损的角质形成细胞中有某些凋亡相关分子的异常表达。为了探讨银屑病中细胞增殖与凋亡的调节及其作用，我们检测了bcl-x、bcl-2、bax在银屑病皮损、非皮损及治疗后皮损消退部位的表皮及真皮中的表达情况，报道如下。

　　材料与方法

　　(一)临床资料：47例银屑病患者均具有典型皮损并经病理证实(以下称皮损组)，且至少1个月内未经特殊治疗。男29例，女18例；年龄14～69岁，平均(39.21±13.80)岁；病程1个月至30年，平均6.8年。除1例红皮病型外其余均为寻常型(点滴状30例，斑块状16例)，其中进行期19例，静止期25例，消退期3例；患者中有19例在距皮损1cm外观正常皮肤处取材(以下称非皮损组)；6例经局部皮质类固醇治疗痊愈后，在原皮损处再次取材(以下称治疗后组)。对照组10例，系非皮肤病非肿瘤手术者的正常皮肤。标本用10％甲醛溶液固定，石蜡包埋并连续切片。

　　(二)免疫组化sp法：切片常规脱蜡水化，加3％h2o2室温处理10min，在枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)中微波加热10min(92～98℃)进行抗原修复，冷却后5％小牛血清室温处理10min，分别滴加1∶50稀释的抗bcl-2单克隆抗体(sc－509)，兔抗bcl-x(sc－1690)及bax(sc－493)，4℃孵育过夜，再分别滴加1∶200稀释的羊抗鼠或羊抗兔2抗，室温处理30min，再加sp(1∶100)工作液室温处理30min，dab显色，苏木素复染，脱水，透明，封片后光镜下观察并摄片。阳性与阴性对照同时进行。所用试剂均为santacruz公司产品。

　　(三)结果判断：以胞质或胞膜有棕黄色颗粒状沉积为阳性。参照krajewska等[1]的评分方法：先按阳性细胞比例将无、1％～25％、26％～50％、51％～75％、76％～100％分别计为0～4分；再按染色强度将无、弱、中、强分别计为0～3分；最后综合各部分得分。例如某片有25％弱阳性(1×1=1)，50％中等阳性(2×2=4)及25％强阳性(1×3=3)，则总分合计为8分。

　　(四)统计学分析：采用spss/pc软件系统。显著性检验水平为0.05或0.01。

　　结果

　　bcl-2、bcl-x、bax阳性细胞呈胞质型，其中bcl-x常伴核周增强现象，bax偶有。bcl-x与bax在表皮中的表达在表皮上层较强，有逐渐向表皮下层减弱的趋势，炎症细胞中阳性的几乎均为单一核淋巴样细胞，中性粒细胞多阴性。另外，毛囊、皮脂腺、小汗腺、汗管、肌肉、神经等亦可见阳性，以bcl-x、bax最多，bcl-2偶见弱阳性。

　　(一)bcl-x：如表1所示，正常对照组表皮、真皮少量淋巴细胞及血管内皮仅弱阳性。而银屑病皮损组(图1)表皮各层、真皮炎症细胞及血管内皮的表达均明显高于正常(p均＜0.01)。非皮损组除角质层及真皮炎症细胞外，均明显高于正常，其中颗粒层、棘层、基底层增高最明显(p＜0.01)，血管内皮次之(p＜0.05)，阳性程度与皮损无明显差异。治疗后组除基底层变化不大外，其余各部分均比皮损组降低，表皮角质层、真皮炎症细胞及血管内皮已基本恢复正常，而颗粒层、棘层、基底层仍高于正常(p＜0.01)。皮损进行期、静止期与消退期之间，点滴状与斑块状之间未见明显差异。

　　图1 bcl-x:银屑病患者皮损表皮角质形成细胞阳性

　　(胞浆型,伴核周增强),真皮炎症细胞及血管内皮部分阳性(×400)

　　表1　bcl-x、bax在银屑病患者及正常人皮肤中的表达

　　部位bcl-xbax

　　阳性例数评分阳性例数评分

　　皮损组(47例)

　　角质层384(0～11)**323(0～8)

　　颗粒层346(2～12)**345(2～11)*

　　棘层476(2～10)**475(2～8)*

　　基底层473(1～7)**473(1～6)

　　炎症细胞443(0～6)**473(1～7)

　　血管内皮463(0～6)**473(1～7)

　　非皮损组(19例)

　　角质层112(0～4)70(0～7)**

　　颗粒层196(2～10)**196(3～10)**

　　棘层196(2～9)**196(3～8)**

　　基底层193(1～6)**193(2～6)**

　　炎症细胞162(0～5)182(0～5)

　　血管内皮153(0～6)*182(0～5)

　　治疗后组(6例)

　　角质层20(0～2)52(0～7)

　　颗粒层64(3～6)**65.5(2～7)

　　棘层64(3～5)**64.5(2～6)

　　基底层63(2～4)**62(2～5)

　　炎症细胞31(0～2)61.5(1～8)

　　血管内皮30.5(0～4)61.5(1～8)

　　正常对照组(10例)

　　角质层61(0～2)104(3～6)

　　颗粒层50.5(0～2)103(1～6)

　　棘层50.5(0～2)103(1～5)

　　基底层20(0～2)72(0～3)

　　炎症细胞71(0～2)92.5(0～5)

　　血管内皮61(0～2)103(1～5)

　　注：各组分别与正常对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

　　(二)bcl-2：与正常对照组[1(0～1)分]相似，银屑病皮损(图2)、非皮损及治疗后组中角质形成细胞几乎未见表达，而仅基底层黑素细胞有不同程度阳性[三组均为1(0～2)分]，真皮少量淋巴细胞及血管内皮亦可见微弱表达，各组间均无明显差异。皮损进行期、静止期与消退期之间，点滴状与斑块状之间亦无明显差异。

　　图2 bcl-2:银屑病患者皮损基层黑素细胞阳性,角质形成细胞阴性

　　(基层一核分裂细胞亦阴性),炎症细胞弱阳性,血管内皮阴性(×400)

　　(三)bax：如表1所示，正常对照组表皮、真皮少量淋巴细胞及血管内皮呈弱阳性。而银屑病皮损组(图3)颗粒层与棘层的表达高于正常(p＜0.05)，其余与正常相似。非皮损组颗粒层、棘层及基底层的表达亦高于正常(p＜0.01)，阳性程度与皮损无明显差异，但角质层低于正常(p＜0.01)。治疗后组的表达稍有降低，介于皮损及正常对照组之间，但差异无显著性。另外，皮损进行期与静止期棘层的表达均高于消退期(p＜0.05)，且静止期角质层的表达明显高于进行期(p＜0.01)。点滴状与斑块状之间未见显著性差异。

　　图3 bax:银屑病患者皮损表皮角质形成细胞阳性(棘层为主),

　　基底层细胞多数阴性或弱阳性,炎症细胞及血管内皮弱阳性(×400)

　　讨论

　　bcl-2、bcl-x、bax蛋白同属bcl-2基因家族编码产物。bcl-2与bcl-x能抑制细胞凋亡，有人认为bcl-x可能与维持角质形成细胞存活，直至终末分化并到达体表才凋亡有关[2]，而bax能促进细胞凋亡[3]。bcl-2/bax或bcl-x/bax之比调控着细胞对凋亡信号的敏感性[1]。我们发现银屑病表皮存在bcl-x与bax的过度表达，而以前者更明显，bcl-2表达则与正常相似。因此推测bcl-x的过度表达抑制了bax诱导的角质形成细胞凋亡并影响其分化(有人认为角质形成细胞的终末分化即角化，也是一种特殊形式的凋亡[4])，引起过度增生与分化异常(如角化不全)。而bcl-x与bax由表皮上层逐渐向下层减弱的分布特点可能与它们相互拮抗的功能有关。有意义的是皮损中bax在角质层的表达正常而非皮损中却低于正常，这种皮损出现前角质层中bax水平的下调是否与以后发生的角化不全(相当于凋亡不全)有关，有待进一步证实。我们还发现，皮损中真皮的炎症浸润细胞表达bcl-x增多，且阳性者几乎均为单一核淋巴样细胞，而治疗后又恢复正常。银屑病中尚存在多种微血管异常(如真皮血管新生、内皮增生、畸形、管腔扩张等)，我们认为bcl-x在血管内皮上大量表达是可能原因之一。表皮及血管内皮bcl-x水平的变化早在非皮损中就已发生，经治疗未完全恢复正常，提示银屑病的发病可能受基因调控，并是皮损复发的基础。本实验发现bcl-2在正常人及银屑病角质形成细胞中几乎阴性，而仅表达于基底层黑素细胞，推测可能与其生存时间较长有关。我们认为bcl-2在银屑病中可能不起重要作用。

　　浙江省教委科研项目

　　参考文献

　　1 krajewska m,krajewski s,epstein ji, et al. immunohistochemical analysis of bcl 2,bax,bcl-x,and mcl-1 expression in prostate cancers. am j pathol,1996,148:1567－ 1576.

　　2 krajewski s, krajewska m, shabaik a, et al. immunohistochemical analysis of in vivo patterns of bcl x expression. cancer res, 1994,54:5501－ 5507.

　　3 sato t, hanada m, bodrug s, et al. interactions among members of the bcl-2 protein family analyzed with a yeast two-hybrid system. proc natl acad sci usa, 1994,91:9238－ 9242.

　　4 fesus l, davies pja, piaceritini m, et al. apoptosis: molecular mechanisms in programmed cell death. eur j cell biol, 1991,56:170－177.

　　(收稿：1998－10－12修回：1999－03－17)