某些致病真菌的聚合酶链反应检测
中华皮肤科杂志 1999年第6期第32卷 短篇论著
作者：朴英兰 李冬梅 王文莉 李若瑜 王端礼
单位：李冬梅 王文莉 李若瑜 王端礼 北京医科大学第一医院皮肤科；朴英兰现在上海铁道大学医学院甘泉医院皮肤科，200065
分子生物学技术的发展为深部真菌感染的诊断提供了新的手段。我们建立一种比其它常规方法更为快速、稳定的体系，以协助临床的早期诊断和治疗。
一、材料和方法
(一)实验菌株：共收集临床株56株，包括白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌、乳酒念珠菌、毛孢子菌和新生隐球菌。另外，atcc模式株7株。烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉各1株。外瓶霉4株。均为北京医科大学真菌研究中心保存菌株。对照包括金黄色葡萄球菌，溶血性链球菌，绿脓杆菌，支原体和4份健康人血dna标本。
(二)模板dna的制备：①酵母菌dna制备：首先于10ml酵母浸膏培养液基中接种一个事先在平皿上培养48h的单菌落，37℃温室中振荡培养48h，再用微波法提取酵母菌dna[1]。②临床标本dna提取：1ml血＋混合物1ml离心2min，弃上清液加1ml0.05mol/ltrisph7.50.01mol/lmgcl2，2min离心，重复2次。弃上清液加入dnasei缓冲液300～500μl。37℃孵育15min。加300μl0.01mol/ledta，85℃30min。2min13000r/min离心,弃上清液。然后用微波法提取酵母菌的dna。曲霉和外瓶霉dna采用氯化苄法提取[2]。
(三)细胞色素p450l1a1基因序列引物:14406cataactcaatatggctatt,14407cttttgacgacatgattcga,dhatgggtggtcaacatacttc,
1558tacatctatgtctaccacc,itsⅰ区引物its1tccgtaggtgaacctgcgg,its2gctgcgttctt
catcgatgc。
(四)目的片段pcr扩增：pcr反应体积为25μl，反应程序为95℃3min→95℃1min→55℃1min→72℃1min（35个循环）→72℃3min。然后取反应产物10μl在2％琼脂糖凝胶电泳上分析，照像。
二、结果
(一)真菌通用引物(its1 its2)：应用its内转录间隔区通用引物，我们从所有受试真菌dna中均获得阳性pcr扩增产物，出现预期的148bp～478bp唯一条带。见图1。
上图1～4为曲霉，5～8为外瓶霉。下图1～8为白念珠菌，m为标记
1 真菌通用引物its1 its2
(二)应用dh-1558念珠菌属特异引物：根据实验中的摸索其扩增产物出现多条非特异性条带，未能达到预期目的。
(三)应用14406/14407白念珠菌特异性引物：经pcr扩增白念珠菌均出现243bp的特异带，见图2。另外，在相同条件下，近平滑念珠菌2条带，季也蒙念珠菌2～4条带，热带念珠菌2条带，克柔念珠菌与新生隐球菌均出现1条特别弱的带。但白念珠菌的带型明显有别于其它念珠菌，使念珠菌种特异性引物首先能鉴别出临床发病率最高的白念珠菌。
1～5白念珠菌，6～8近平滑念珠菌，m为标记
2 细胞色素p450l1a1白念珠菌特异性引物14406/14407
(四)血标本的检测：采用撒菌方法，血液来自健康志愿者，白念珠菌倍比稀释（106～101个菌）后加入血液中，dna提取所需时间约6h左右，经pcr扩增出现与预期结果相同的条带。在血液中60～70cfu/ml即可出现阳性结果。阴性对照株应用上述引物pcr扩增结果均为阴性。
三、讨论
有文献报道选用编码rrna基因的可变区设计引物，扩增its2区，我们亦选用its为扩增片段，用its1、its2为通用引物，与基因数据库的有关序列进行比较，所有菌株均扩增出1条清晰的dna带型，片段为150～480bp之间，与预期结果一致。在扩增时引物浓度也尤为重要，its1∶its2=50/(1～2.5)pmol/μl时条带才会出现，否则其pcr结果检测不稳定。
我们根据buchman等[3，4]1994年报道，从中选择了细胞色素p450l1a1基因片段dh-1558为属通用引物，同时与啤酒酵母、白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌p450l1a1基因序列相比较：用引物分析软件分析这对引物发现，在上游引物间有一发夹结构，在下游引物的3′端亦有一发夹结构，去除了下游引物3′端的两个碱基ac后,发夹结构就消失了。与光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、酿酒酵母比较，引物在其它位置均有不同程度的错配。由于其结构的复杂性，扩增产物出现较多条带，摸索多种不同浓度的比例仍未能扩增出预期所需条带。
卫生部部属院校临床学科重点项目资助课题
参考文献
1 goodwin dc, lee sb.microwave miniprep of total genomic dna from fungi,plant,protists and animals for pcr. biotechniques,1993, 15:438.
2 zhu h, jun f, zhu lh. isolation of genomic dna from plant, fungi and bacteriol using benzyl chloride. nucl acid res,1993, 21:5279.
3 vernon fk, connie ww, thomas gt, et al. primary structure of the p450 lanosterol demethylase gene from saccharomyces cerevisiae. dna,1997,6:529－ 537.
4 chen c, vemon fk, thomas gt, et al. primary structure of the cytochrome p450 lanosterol 14α demethylase gene from candida tropicalis. dna,1998, 7: 617－627.
(收稿：1999－01－29修回：1999－05－07)
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