绿色荧光蛋白基因转染角质形成细胞的瞬时表达检测

2015-09-30 17:20:58

　　中华皮肤科杂志 1999年第4期第32卷技术与方法

　　作者：廖文俊　叶苓　刘彦仿　刘玉峰

　　单位：710032西安，第四军医大学西京医院皮肤科(廖文俊　刘玉峰)；第四军医大学基础部病理学教研室(叶苓　刘彦仿)

　　近来的研究已发现皮肤角质形成细胞具有许多功能和活性，它不仅符合基因治疗中靶细胞的基本条件，而且还具有许多优点，如取材方便、易于回植、便于观察和调控基因表达情况及副作用，因而，角质形成细胞被认为是一种理想的靶细胞。为了证实角质形成细胞作为基因转染、基因表达及基因治疗中靶细胞的可行性，本实验将pegfp-n3质粒转染皮肤角质形成细胞，并对其瞬时表达情况进行了检测。

　　一、材料和方法

　　(一)实验材料：质粒：pegfp-n3质粒由本校病理学教研室赵利军博士惠赠(clontechlaboratones,inc产品)，该质粒在细胞内表达后，可发出绿色荧光。主要试剂：角质形成细胞无血清培养基(kc-sfm)、脂质体转染试剂盒(lipofectaminetm)均为美国gibcobrl公司产品。

　　(二)方法：

　　1.质粒鉴定及制备：参照《分子克隆操作指南》中的碱裂解法提取质粒[1]，取少量质粒用notⅰ、xhoⅰ做双酶切，1％琼脂糖电泳鉴定酶切结果。

　　2.角质形成细胞培养：取手术包皮(本校西京医院门诊手术室提供)用0.25％洗必泰液浸泡和无菌生理盐水漂洗。用无菌眼科剪尽量剪去皮下组织，将皮片剪成0.3cm×1cm大小之皮块，加0.25％dispase5ml，置4℃消化过夜(约16h)。次日用无菌镊分离真表皮，将表皮部分放入50ml离心管中，再用0.25％胰酶室温消化10min，小心吸除上层胰酶，用含10％小牛血清的dmem培养液终止消化，并用吸管反复轻柔吹打，200目筛网过滤除渣，除去角质层，收集液放入另一50ml离心管中，离心弃上清液，沉淀用dmem培养液洗涤细胞2次，离心10min，以事先配制好的kcsfm制成细胞悬液，接种于铺有盖玻片的6孔板中(1×106)，置37℃培养至细胞生长达70％融合时进行基因转染。

　　3.基因转染(lipofectaminetm法)：参照lipofectaminetm试剂盒说明书进行。主要步骤如下：在无菌管中配制：溶液a：2μg质粒(pegfp-n3)溶于100μlopti-mem培养液；溶液b：10μllipofectamine溶于100μlopti-memi培养液。混合溶液a和溶液b，轻柔摇动，室温放置30min后，加0.8mlkc-sfm，轻柔摇动。吸尽培养板中的培养液，将质粒-lipofectamine复合物覆盖到细胞表面，置37℃孵箱中培养5h(其间每隔30min轻摇培养板)后，加2ml含20％小牛血清的dmem培养液终止反应，18h后换成kc-sfm。分别于转染后36h、48h、72h取出贴附细胞的盖玻片进行检测。实验中设未转染细胞做对照。

　　4.转染pegfp-n3细胞的荧光显微镜观察：4％多聚甲醛(pbs配制)室温固定30min后，pbs洗2次，在荧光显微镜下，488nm激发波长下观察，表达pegfp-n3的细胞发绿色荧光。

　　二、结果

　　1.酶切鉴定结果：pegfp-n3经xhoⅰ和notⅰ双酶切后，电泳显示有一条700kb的片段和载体片段。证明所获质粒确为pegfp-n3。

　　2.绿色荧光蛋白的表达：转染后36h组即可见发绿色荧光的细胞，但强度较弱；48h组阳性细胞明显增多，每个低倍视野(10×)可见2～5个，多为明亮的绿色荧光，少数发出弱荧光，主要集中在胞浆内。72h组，发光细胞的荧光强度最强，且胞核也有荧光(图1)。这些细胞多成堆或成对出现，有的区域可见8～10个聚集在一起的荧光细胞。未转染细胞未见绿色荧光。

　　1　转染后72h角质形成细胞表达egfp(亮绿色荧光)

　　三、讨论

　　来源于jellyfishaequoreavictoria的绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)目前已被作为一种新型的报告分子用于检测细胞的基因表达和蛋白定位。它在暴露于紫外线后即可发出明亮的绿色荧光，并可在荧光显微镜下观察到这种绿色荧光[2]。gfp是一种由238个氨基酸组成的单体，相对分子质量为27000。与其它发光性报告分子不同，gfp不需要另外的蛋白质、底物或共同因子，但只有完整的gfp才能发出荧光。gfp荧光比较稳定，无种系依赖性，表达gfp的活细胞经甲醛固定后，绿色荧光可持续存在于细胞中。gfp已用于在从大肠杆菌到哺乳类动物的一系列细胞中进行表达，并被认为是一种适用于不同情况、不同领域基因表达研究的通用报告基因。

　　egfp是一种最佳化的突变型gfp，其基因编码序列含有190多个沉默碱基突变，结果产生一个更适合于在人类细胞中表达的开放读框，而且egfpmrna的翻译效率提高，egfp的表达增强，所产生的荧光比野生型gfp强35倍。因而，这种报告分子更适用于检测各类细胞中egfp和egfp融合蛋白的表达情况。

　　我们在实验中发现，pegfp-n3在转染角质形成细胞后36h即开始表达，48h发光细胞明显增多，但在表达水平上存在差异，多数细胞为强荧光，部分细胞仅发出弱荧光，表达细胞的数量及荧光强度均以转染后72h为最高。我们还发现，转染后72h可观察到成对出现的发光细胞，这一现象在plautz等的文献中曾有报道[3]，他们将gfpcdna转染gh3垂体瘤细胞系后，发现一些细胞发生分裂，对每个细胞中gfp的表达水平进行定量分析，结果显示，瞬时转染的细胞发生分裂后gfp也被分配到了两个子代细胞中。由于只有完整性gfp才能发出绿色荧光，我们在实验中成功表达egfp，提示外源基因能在角质形成细胞内进行有效的复制、转录、翻译和正确的翻译后修饰，且外源基因表达所需的一些调控元件也能在角质形成细胞中有效地工作。我们的实验说明：以角质形成细胞作靶细胞进行基因转染、基因表达的策略是可行的，并有望应用于基因治疗。

　　国家自然科学基金资助项目(39570656)

　　参考文献

　　1 sambrook j, fritsch ef, maniatis t.分子克隆实验指南.张励，石立成，译.第2版.北京：科学出版社,1992.17－34.

　　2 yang tt, cheng lz, kain sr. optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. nucleic acids res, 1996,24:4592－ 4593.

　　3 plautz jd, day rn, dailey gm, et al. green fluorescent protein and its derivatives as versatile markers for gene expression in living drosophila melanogaster, plant and mammalian cells. gene, 1996,173:83－ 87.

　　收稿：1998－08－11修回：1998－11－30