解脲支原体第一群MB抗原基因5′端基因片段的克隆表达及抗原性研究

2015-09-30 17:21:49

解脲支原体第一群mb抗原基因5′端基因片段的克隆表达及抗原性研究

中华皮肤科杂志 1999年第3期第32卷短篇论著

作者：王玮蓁　孔繁荣　朱学骏　陈　洪　任桂珍

单位：作者单位：王玮(现在武汉市第一医院皮肤科430022)　孔繁荣　朱学骏　100034北京医科大学第一临床医院皮肤科；陈洪　中国科学院动物研究所；任桂珍　首都儿科研究所

　　解脲支原体(uu)在人类疾病感染中的特征仍有争议，已知感染人类的uu具有种的特异性，用血清学的方法将其分为2个生物群及14个血清型，其中1、3、6、14为第1群，其余的10型为第2群[13]。teng等[4]的研究认为uu的群特异性和多样性被编码在mb(multiplebanded)抗原基因中，本研究用第1群的uu3、14标准株对mb抗原5′端含群特异性抗原决定簇部分进行了pcr扩增，并对其表达的蛋白片段进行了抗原性检测。

　　一、材料与方法

　　1.uu3、14型标准株、uu3、6、8、14型标准抗血清由首都儿科研究所提供；pgex－2t、感受态大肠杆菌dh5α由中国科学院动物所提供。

　　2.pcr扩增：①dna模板制备：uu3、14型标准株的dna制备按我科实验室常规操作提取。②引物设计：参照teng的设计合成一对特异性引物：ums51：5′tgtggatccttctgggctatgacattaggtgttacc3′；uma427：5′ctcgaattcacctggttgtgtagtttcaaagttcac3′(cybersyn公司合成)。在上游引物和下游引物分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点。③25μl反应体系：其中引物ums51、uma427、dna模板各1μl。④反应条件：94℃、62℃、72℃各1min，35个循环。扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳及dna片段回收试剂盒回收和纯化。

　　3.重组表达质粒的构建：将目的dna片段及表达质粒pgex－2t分别经bamhⅰ和ecorⅰ酶切处理，得到粘性末端，在t4dna连接酶的作用下连接，将重组质粒转化到大肠杆菌dh－5α中，用酶切和pcr的方法挑选阳性菌落。

　　4.iptg诱导蛋白的表达：设含有生殖支原体304bp的重组质粒及空白载体pgex－2t为对照。诱导剂iptg的终浓度为0.1mmol/l，诱导时间4h。超声粉碎细菌后，加入等体积的2×sds加样缓冲液，100℃加热3min，10000r/min，离心5min，取上清液20μl进行sds－page凝胶电泳。

　　5.western印迹法检测表达蛋白的抗原性：①将表达的蛋白经sds－page凝胶电泳后，按常规方法将其转至硝酸纤维膜(nc)上，将nc膜用含3％bsa的封闭液室温封闭1、2h。②兔uu3、6、8、14型抗血清1∶10稀释后用大肠杆菌dh5α裂解液预吸收4h，然后用血清稀释液稀释至1∶500，分别与nc膜4℃孵育过夜，次日用hrp标记的抗兔igg室温反应1h。③酶底物联苯二胺(dab)用底物缓冲液配制：将nc膜置入dab溶液中显色。

　　二、结果

　　1.用ums51uma427扩增uu3、14型标准株，得到429bp的目的dna片段。克隆并经酶切和pcr方法筛选阳性克隆菌株。

　　2.iptg诱导蛋白表达结果：含uu3、14型目的dna片段表达质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约43000的融合蛋白，仅含pgex2t的大肠杆菌表达相对分子质量约26000的蛋白片段，含生殖支原体重组质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约35000的融合蛋白。

　　3.western印迹法检测结果：含uu3、14型mb抗原基因5′端重组质粒的阳性克隆诱导表达的蛋白片段与uu3、6、14型标准抗血清均出现明显的阳性反应，与uu8型抗血清未见条带出现。

　　三、讨论

　　mb抗原是uu的外膜抗原，在人类感染中为占优势的识别抗原，根据对uu3型的mb抗原基因序列分析，mb抗原为一个1230bp开放性的阅读框架，可编码409个氨基酸。在teng等的研究中证实，mb抗原基因存在于所有的血清型中，基因的5′端区域是群特异性的标志[4]。在不同的血清型，mb抗原的大小可能是不同的，但其5′端的n区是保守的。

　　本研究参照teng对uu3型的mb抗原基因5′端设计的引物ums51－uma427扩增出uu3、14型mb抗原基因的5′端，得到约429bp的目的dna片段，克隆后，用iptg在大肠杆菌中成功诱导了相对分子质量43000融合蛋白的表达，除去pgex－2t质粒本身表达的相对分子质量约26000蛋白片段，得到预期大小相对分子质量17000的表达蛋白。并证实uu3、14型mb抗原基因5′端基因片段所编码的蛋白片段含有第1群特异的抗原决定簇。uu6型在第1群中由于不含hinfⅰ酶切位点，表现出第2群的特征，在亲缘关系上与其他3型可能相对较远，我们选择uu6型的抗血清与表达的蛋白仍然出现明显的阳性反应，证实该蛋白片段确为第1群所共有。由于uu3、14型所表达的蛋白与抗血清的反应完全相同，提示其具有相同的抗原决定簇。这一结果支持了teng提出的mb抗原的n端存在群特异性的抗原决定簇的结论。

　　在目前的支原体检测中，多在培养后再进一步分群或分型，需较长的时间；pcr方法虽省时，但假阳性或假阴性均高，与操作者的水平密切相关。本研究采用基因重组技术得到含第1群mb抗原基因5′端基因片段的克隆菌株，为大量制备含mb抗原保守区的融合蛋白提供了条件，其蛋白作为抗原可制备抗体用于临床检测，为大批量标本的分群提供了方便。也可作为抗原检测血清中的抗体，为探讨临床疾病与解脲支原体感染的生物群之间的关系提供基础。

　　参考文献

　　1 robertson ja, vekris a, bebear c, et al. polymerase chain reaction using 16s rrna gene sequences distinguishes the two biovars of ureaplasma urealyticum. j clin microbiol, 1993,31:824－ 830.

　　2 teng lj, ho sw, ho hn, et al. rapid detection and biovar differentiation of ureaplasma urealyticum in clinical specimens by pcr. j formos med assoc, 1995,94:396－ 400.

　　3 grattard f, pozzett b, barbexrac b, et al. arbitrarily primed pcr confirms the differentiation of strains of ureaplasma urealyticum into two biovars. mol cell prob, 1995,9:383－ 389.

　　4 teng lj, zheng x, glass ji, et al. ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple banded antigen gene. j clin microbiol, 1994,32:1464－ 1469.

(收稿：1998－04－16修回：1998－10－21)