银屑病皮损区il-8、hla-dr、pla2、anae、egfr mrna、c-fos mrna的定位研究
中华皮肤科杂志 1999年第2期第32卷 论著
作者：李红文 吴景兰 丁一 王一菱 时建业 王诗淇 付世珍
单位：李红文 王诗淇 付世珍 450052 郑州，河南医科大学第一附属医院皮肤科；吴景兰 丁一 王一菱 河南医科大学细胞分子生物学中心；时建业 河南禹州禹灵集团
关键词：银屑病；白细胞介素8；hla－dr；磷脂酶a类；基因，fos；基因；erbb-1
【摘 要】 目的 探讨银屑病患者白介素8(il-8)、人类白细胞抗原dr(hla-dr)、磷脂酶a2(pla2)、酸性α-乙酸萘酯酶(anae)、表皮生长因子受体基因(egfr mrna)、c-fos基因(c-fos mrna)在皮损的表达定位。方法 对20例银屑病患者皮损和10例正常人的皮肤标本进行了免疫组化、组化和原位杂交技术检测。结果 il-8免疫反应主要定位于表皮的基层、棘细胞层和颗粒层、血管内皮细胞及间质细胞；人类白细胞抗原dr免疫反应及anae分型染色主要定位于浸润细胞[包括单核巨噬细胞及t辅助淋巴细胞(th细胞)]和血管内皮细胞；pla2活性主要定位于表皮细胞的胞膜及角层和间质细胞；以上观察指标在皮损区反应均较强或反应细胞较多；c-fos mrna的杂交信号皮损区弱于对照区；egfr mrna在皮损区杂交信号虽较强，但与对照组相比差异不显著。结论 il-8及其介导的免疫炎症反应在银屑病发病中起着十分重要的作用，并使pla2活性增强，淋巴细胞激活。c-fos原癌基因在增殖的角质形成细胞中呈弱表达，提示其终末分化较差。而egfr mrna的表达强度则与银屑病无显著相关关系。而il-8与hla-dr和th细胞之间呈明显正相关(p＜ 0.01)。
study on localization of il-8、hla-dr、pla2、anae、egfr
mrna and c-fos mrna in psoriatic lesions
li hongwen, wu jinglan, ding yi,et al.department of dermatology, first affiliated hospital, henan medical university, zhengzhou 450052
【abstract】 objective to study the localization of interleukin-8 (il-8), hla-dr, phospholipase a2 (pla2), acid α-naphthyl acetate esterase (anae), epidermal growth factor receptor mrna (egfr mrna), c-fos mrna in psoriatic skin.methods
skin lesions of 20 psoriatic cases who received no treatment in previous three months and skin samples of 10 controls were detected by histochemistry, immunohistochemistry and in situ hybridization technique.results il-8 was mainly localized at the basal cell layer, spinous cell layer and granular cell layer of the epidermis, the endothelium of the blood vessels and interstitial cells; hla-dr and anae were mainly localized at the infiltrating immune cells in dermis (including th cells and mononuclear phagocytes) and the endothelial cells of the blood vessels; pla2 reaction was mainly seen at the cytomembrane of keratinocytes in deeper epidermal layers, cornified layer and dermal interstitial cells. all above mentioned positive reactions were more intense, or there were more positive cells in psoriatic lesions than those in controls. c-fos mrna signal were weaker in lesions than that in controls. egfr mrna signal was more intense in lesions, but there was no significant difference between those in the lesions and in controls.conclusion
the results suggest that il-8 and its mediated inflammatory reactions might play an important role in the development of psoriasis, and it also enhances pla2 activity and activates lymphocytes. c-fos protooncogene is weakly expressed in proliferative keratinocytes. no distinctive correlation between egfr mrna and the development of psoriasis is found.
【key words】 psoriasis interleukin-8 hla-dr phospholipasesa genes,fos
genes,erbb-1
银屑病是常见的、 具有遗传倾向的慢性炎症皮肤疾患。近年来研究表明，由于患者th细胞(t辅助淋巴细胞)被激活，释放的细胞因子刺激角质形成细胞分泌细胞趋化因子。这些细胞因子一方面刺激表皮细胞增生，另一方面趋化血液中白细胞作用于血管内皮细胞产生炎症反应[1，2]。我们研究了银屑病皮损区与正常皮肤区的白介素－8(il-8)、人类白细胞ⅱ类抗原(hla-dr)、磷脂酶a2(pla2)表达和酸性α－乙酸萘酯酶(anae)染色进行淋巴细胞分型等与炎症相关的指标。此外尚对比观察表皮生长因子受体基因(egfr mrna)表达和与皮肤终末分化相关的c-fos基因的表达。
资料和方法
一、临床资料
20例寻常型银屑病患者，均为我院门诊患者，男12例，女8例，年龄19～52岁，平均37岁，病程2个月至11年；另选对照组10例，均为正常健康者，性别年龄与实验组匹配。两组均排除慢性炎性病史，3个月内均未使用抗生素及免疫制剂。
二、方法
样本分别以丙酮或bouin固定后常规石蜡包埋，切片5μm厚。以组化方法显示pla2。anae染色进行淋巴细胞分型。免疫组化法：il-8鼠抗人单克隆抗体(加拿大yele公司馈赠)1∶1000 pbs稀释(1抗)，4℃孵育过夜。兔抗鼠igg－碱性磷酸酶(华美公司)1∶200 tbs稀释，37℃，30～60min(2抗)。加底物[5－溴4－氯3－吲哚磷酸(bcip)，硝基蓝四唑盐(nbt)]显色。hla-dr鼠抗人单克隆抗体(华美公司)(1抗)1∶1000 pbs稀释，4℃孵育过夜，余同il-8。原位杂交：参照larsson法，主要步骤如下：切片脱蜡；0.3％ triton x－100/pbs，30min。5μg/ml蛋白酶k(sigma公司)，37℃，10min。42℃预杂交2～3h；分别加bio-11-dutp标记的egfr cdna探针(0.3μg/ml)和bio-11-dutp标记的c-fos cdna探针(0.5μg/ml)，42℃，杂交12～16h。0.1×ssc，42℃，4×15min。链霉亲合素(sa)，1∶1000，37℃，20min；生物素碱性磷酸酶(bio-ap)，1∶500，37℃，20min；加新鲜配制底物(nbt.bcip)显色。以不加探针杂交和rnase(promega公司)100μg/ml，37℃，60min,给予消化rna为对照标本。实验结果及统计学分析：il-8、hla-dr、pla2、egfr mrna、c-fos mrna显示的信号是蓝紫色颗粒。anae染色则呈棕红色颗粒。部分胞质显示弱信号的计为2分，整个胞质显示弱信号的为4分。整个胞质显示强信号的为6分。油镜下在1个视野内连续计数100个细胞。实验结果用x±s表示，两样本均数比较采用t检验。il-8与hla-dr和th提高率间采用直线相关分析。
结 果
1.il-8免疫反应(il-8-ir)定位于表皮的基层、棘细胞层、颗粒层的细胞质内及角质层、真皮血管内皮细胞及个别间质细胞。
2.hla-dr免疫反应(hla-dr-ir)主要定位于真皮内浸润细胞的胞质内(单核巨噬细胞、th细胞及血管内皮细胞)，皮损区浸润细胞明显增多。
3.pla2酶活性呈蓝色细颗粒，主要定位于表皮深层细胞的胞膜及角质层和真皮间质细胞周缘部，表皮镜下呈空泡状。
4.anae活性：主要定位于皮肤真皮的浸润细胞的胞质内(th细胞及巨噬细胞)，th细胞是anae染色点样型。
5.c-fos mrna杂交信号主要定位于皮肤表皮的基层及浅层的角质层细胞和皮脂腺干细胞胞质内。
6.egfr mrna杂交信号主要定位于皮肤表皮的深层细胞胞质内及皮脂腺干细胞胞质内。
7.il-8与th细胞(anae染色点样型细胞)和hla-dr表达强度提高率间呈明显的正相关，分别为r=0.98，p＜0.01和r=0.88，p＜0.01。
8.定量分析结果：见表1。egfr mrna患者组与对照组间无显著性差异。c-fos mrna对照组高于患者组，其他4组患者组均高于对照组，并有显著性差异。
表1 寻找型银屑病患者皮损il-8,hka-dr,pla2,anae,c-fos mrna,egfr mrna 测定
| 分 组 | 例数 | il-8 | hla-dr | pla2 | anae | c-fos mrna | egfr mrna |
| 患者组 | 20 | 1.75±0.31 | 1.57±0.39 | 3.76±0.37 | 0.50±0.08 | 1.22±0.28 | 1.69±0.23 |
| 对照组 | 10 | 1.14±0.41 | 1.04±0.34 | 3.25±0.28 | 0.32±0.02 | 2.20±0.55 | 1.55±0.29 |
| t值 | - | 2.383 | 2.391 | 2.873 | 3.157 | 2.129 | 1.388 |
| p值 | - | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.05 | ＞0.05 |
讨 论
(一)关于银屑病皮损区的炎症反应：此项研究观察到皮损区表皮基层、棘细胞层、颗粒层、血管内皮细胞及间质成纤维细胞il-8较对照区免疫反应性增强。这一方面提示皮损区血管内皮细胞可能生成较多的il-8；另一方面提示内皮细胞的il-8通过其受体与白细胞之间的作用可能加强，促进了趋化作用和免疫细胞的炎症反应。konstantinova报道il-8定位于表皮的颗粒层[2]，本研究见到il-8除颗粒层外尚定位于表皮基层。hla-dr主要分布于激活的th细胞，单核巨噬细胞和其它抗原递呈细胞等。本研究观察到皮损区的hla-dr阳性细胞明显多于对照组，尚可见于血管内皮细胞呈较强hla-dr反应。这提示与抗原递呈作用在皮损区较强有关。在皮损区anae点样型细胞多于对照区。
pla2酶活性增高使细胞膜磷脂水解释放花生四烯酸增多，又通过系列酶的作用可合成前列腺素(pg)和白三烯(lts)等生物活性物质，促进炎症的发展。本研究观察到pla2酶活性主要定位于表皮细胞胞膜，尤其是存在于角质层和散在间质细胞。皮损区pla2酶活性高于对照区，结果提示皮损区的pg及lts酶解产物或诱导促进炎症反应的活性物质可能较多。
(二)关于银屑病皮损区表皮增生及异常角质化问题：近年研究表明过度表达的ras[3]和tgfα[4](转化生长因子α)基因可使表皮呈现角质形成细胞加快生长并使表皮呈现潴留型角化的表型。国内外有关银屑病egfr基因变化报道不尽一致[5]。此项研究结果见到egfr mrna杂交信号主要定位于皮肤表皮深层细胞胞质内和皮脂腺基部干细胞胞质内。皮损区比对照区信号虽较强，但不显著。本研究尚观察到c-fos mrna杂交信号定位于皮肤表皮基层及角质层细胞、皮脂腺干细胞胞质内，此外，尚定位于皮肤表皮的浅层。
志谢 承蒙朱钵教授审阅
河南省卫生厅资助课题
参考文献
1 陈红清综述. 皮肤白细胞移行与银屑病. 国外医学皮肤性病学分册, 1995，21:267－270.
2 konstantinova nv, duong d-mt, remenyik e, et al. interleukin-8 is induced in skin equivalents and is highest in those derived from psoriatic fibroblasts. j invest dermatol, 1996，107:615－621.
3 henrard dr, thornley at, brown ml, et al. specific effects of ras oncogene expression on the growth and hisogenesis of human epidermal keratinocytes. oncogene,1990,5:475－479.
4 nanney lb. epidermal and dermal effects of epidermal growth factor during wound repair. j lnvest dermatol, 1990,94:624－629.
5 kobayashi h, yasude h, matsue h, et al. epidermal growth factor receptor mrna is not increased in psoriatic skin,j dermatol,1990,17:104－107.
(收稿：1998－05－26 修回：1998－11－13)
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