银屑病患者外周血T淋巴细胞酪氨酸蛋白激酶活性的初步研究

2015-09-30 17:22:16

　　银屑病患者外周血t淋巴细胞酪氨酸蛋白激酶活性的初步研究

　　中华皮肤科杂志 1999年第2期第32卷短篇论著

　　作者：吕根法　李文维　伍津津

　　单位：吕根法　　471003 河南省洛阳市，解放军五三四医院皮肤科；李文维　伍津津　　第三军医大学大坪医院皮肤科

　　银屑病是一种常见的炎性增生性皮肤病，尽管其发病机理目前尚不清楚，但表达hla-2、白介素2(il-2)受体等活化标志的t淋巴细胞在发病中的作用愈来愈受到人们的关注，局部浸润激活的t淋巴细胞一方面产生大量的生长因子/细胞因子，通过旁分泌作用于角质形成细胞直接刺激表皮增生；另一方面通过影响代谢，发挥促增生作用[1]。t淋巴细胞激活伴有酪氨酸残基的磷酸化，酪氨酸蛋白激酶(tpk)在淋巴细胞激活、分化调控中具有重要的生理功能[2]。我们通过对银屑病外周血t淋巴细胞tpk活性的研究，以探讨tpk在t淋巴细胞异常激活中的作用，为银屑病发病机理和治疗的研究提供一定的依据。

　　一、材料和方法

　　1.标本来源：进行期寻常型银屑病22例，男13例，女9例，年龄18～45岁，平均年龄28.4岁；17例正常人对照组，男10例，女7例，年龄22～41岁，平均年龄26.3岁。两组性别、年龄无统计学差异。常规采取10ml全血加入柠檬酸钠抗凝。

　　2.t淋巴细胞膜制备[3]：全血用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞，再通过尼龙毛纯化出t淋巴细胞。加入刀豆素a(cona)(每1×106t淋巴细胞加入20μg/ml)，37℃、5％ co2孵箱内分别孵育0h、2h、4h、8h。将t淋巴细胞置于匀浆液内(50mmol/l tris, ph7.4,1mmol/l egta, 1.5mmol/l mgcl2,100mmol/l naf,0.5mmol/l pmsf,250mmol/l庶糖，5mmol/l dtt)，冰水浴内匀浆破膜，1000r/min离心10min，上清液再100 000r/min、4℃离心90min，放入－70℃冰箱内保存。1个月内测定tpk活性。

　　表1　银屑病患者t淋巴细胞膜酪氨酸蛋白激酶活性(±s,fmol．mg-1蛋白)

　　组　别例　数基础状态cona刺激

　　2h4h8h

　　对照组1766.87±21.34121.03±13.60258.22±30.45252.27±32.45

　　银屑病2225.05±8.6267.14±6.05250.63±39.23339.84±42.07

　　t值-8.073.471.067.31

　　p值-＜0.01＜0.01＞0.05＜0.01

　　3.t淋巴细胞膜tpk活性测定[3]：反应体系总体积50μl，含终浓度为20mmol/l tris-hcl,ph7.0，50mmol/l mgcl2,25μmol/l正矾酸钠，0.1％ triton x-100,polyglu∶tyr(4∶1)1mg/ml，膜蛋白10μg，反应以加入[γ-32p]-atp(0.4μci/管)启动，30℃反应5min。加入10μl 0.5mol/l edta,ph8.0，终止反应，对照管终止反应时加入polyglu∶tyr(4∶1)。每个反应平行3管。取反应液40μl点样于0.22μm微孔滤膜，以10％三氯醋酸负压抽滤，lklb-127型液体闪烁机计数。tpk的活性以每mg膜蛋白每分钟催化32p转入到多聚谷酪氨酸(4∶1)的fmol数减去自磷酸化的tpk活性值来表示。

　　4.统计学处理：采用第三军医大学数学教研室编制的《医用统计程序包spmr》中的t检验。

　　二、结果

　　在基础状态下，正常人外周血t淋巴细胞tpk活性(66.87)显著高于银屑病组(25.05)(p＜0.01)；当用cona分别孵育2h、4h、8h，t淋巴细胞膜tpk活性呈现时间依赖性增高，但银屑病组反应明显强于正常人组，4h已基本达到至正常人水平，8h显著高于正常人对照组(p＜0.01)。

　　三、讨论

　　tpk系统在淋巴细胞的免疫激活中具有重要的作用。本实验结果发现，在基础状态下，银屑病外周血t淋巴细胞tpk活性显著降低，t淋巴细胞tpk活性的降低将直接影响细胞免疫功能，这可能是引起银屑病中细胞免疫功能低下的重要原因。研究发现银屑病外周血中存在一种能在体外抑制正常人t淋巴细胞形成花环的因子，它与t细胞上cd2(即e花环受体)结合后，可使淋巴细胞功能低下[4]，但是否cd2分子的封闭是引起tpk活性降低的主要原因仍需进一步研究。cona与t细胞具有高度亲合性，可使t细胞表面的e花环受体恢复或使阻断因子从细胞表面脱落。许桦等[5]发现随着孵育时间延长，t细胞e花环形成率逐渐增高，8h完全恢复正常。本研究结果示经过cona孵育后，t淋巴细胞的tpk活性呈时间依赖性增高，4h已经达到正常，8h显著增高，推测可能是由于：1cd2功能的恢复，启动旁路激活途径；2银屑病t淋巴细胞存在多种tpk的活性增高，增高的tpk活性催化更多底物酪氨酸磷酸化；3tpk的负调节剂蛋白酪氨酸磷酸化酶的活性发生改变。对cona刺激的不同反应提示银屑病中t细胞的tpk系统不同于正常人。

　　参考文献

　　1　norris da, travers jb, leung dym. lymphocyte activation in the pathogenesis of psoriasis. j invest dermatol, 1997,109:1－4.

　　2　klaausner rd. t cell receptor tyrosine phosphorylation. j biol chem, 1987,262:12654－12659.

　　3　trevillyan jm, nordstrom a, linna tj. high tyrosine-specific protein kinase activity in normal human peripheral blood lymphocytes. biochem biophys acta, 1985;845:1－9.

　　4　carno am, mason dw, beyers ad, et al. physical association of the cytoplamic domain of cd2 with the tyrosine kinase p56lck and p59fyn. eur j immunol, 1993,23:2196－2201.

　　5　桦, 姜凯，蒋仲元，等. 银屑病e花环功能和抑制因子的初步研究. 中华皮肤科杂志, 1985,18:73－75.

　　(收稿：1998－08－14 修回：1998－12－07)