环孢素a及雷公藤内酯醇对cd4＋t细胞、角质形成细胞和hela细胞增殖的影响
中华皮肤科杂志 1999年第2期第32卷 论著
作者：李新宇 郑家润 徐兰芳 高纪伟
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所研究所；本文所用缩写：cya：环孢素a，pbmc：外周血单一核细胞，hela细胞：人子宫颈鳞状上皮癌细胞，t0：雷公藤内酯醇
关键词：银屑病；cd4阳性t淋巴细胞；角蛋白细胞；雷公藤内酯；环孢菌素
【摘 要】 目的 比较环孢素a(cya)和雷公藤提取物t0对cd4＋t细胞、角质形成细胞和hela细胞增殖的影响。 方法 采用人外周血单一核细胞(pbmc)、人表皮角质形成细胞和hela细胞培养，3h-tdr掺入法测定药物对细胞dna合成的影响。结果 t0和cya都能抑制cona诱导的人外周血t淋巴细胞增殖。t0在体外可抑制生长于低钙无血清角质形成细胞培养基中的正常人角质形成细胞和hela细胞株的生长，而cya在药理浓度下无抑制作用。结论 t0与cya均能抑制t细胞增殖，但对上皮细胞的作用不同。
effects of anti-psoriatic agents on proliferation of cd4＋t cells,
hela cells and keratinocytes
li xinyu,zheng jiarun,xu lanfang,et al.
institute of dermatology, chinese academy of medical sciences, peking union medical college, nanjing 210042
【abstract】 objective to compare the anti－proliferative action of the compound t0 extracted from tripterygium wilfordii, a traditional chinese herb, and known effective drug cyclosporin a(cya) on human t lymphocytes(t cells)， keratinocytes and hela cells.methods human pbmc, keratinocytes and hela cells were cultured in rpmi 1640 medium and serum-free keratinocyte medium, respectively. 3h-tdr incorporation was employed to assay the effects of these drugs on dna synthesis of the cells.results both t0 and cya were capable of inhibiting cona-induced proliferation of t cells.to inhibited the growth of keratinocytes and hela cells in vitro, but cya did not.conclusion both t0 and cya inhibit the proliferation of t cells, but their action on epithelial cells is quite different.
【key words】 psoriasis cd4-positive t-lymphocytes keratinocytes
triptolide cyclosporine
银屑病免疫发病机理概念认为[1-3]，该病是多基因遗传背景下t细胞失常的免疫性疾病，cd4＋t细胞是发病的关键细胞, 角质形成细胞是疾病发生过程中病变集中表现的细胞。我们比较了环孢素a(cya)与临床上治疗银屑病有效但作用原理尚不明确的天然药物雷公藤(以其提取物t0为试验药)对cd4＋t细胞、角质形成细胞和人子宫颈鳞状上皮癌细胞(hela细胞)增殖的影响，为抗银屑病药物作用靶位及药效学方法的研究提供依据。
材料与方法
一、材料
1.细胞: 人外周血单一核细胞(pbmc)取自健康志愿者周围血，用ficoll液分离制备。人表皮角质形成细胞取自外科门诊正常人包皮环切手术切除的标本，自行分离制备。hela细胞(中国科学院上海细胞生物细胞库)。
2.培养基: rpmi 1640培养基，低钙角质形成细胞无血清培养基(gibco/brl)。
3.药物: cya(杭州中美华东制药有限公司)。蒽林和雷公藤内酯醇(t0，本所药物研究室)。鬼臼毒素(北京协和医院皮肤科王宝玺副教授惠赠)。
4.仪器：ls－6500 β－闪烁计数器(beckman)。
二、方法
1.药物对cona诱导的人t淋巴细胞增殖的抑制试验：人pbmc用rpmi 1640完全培养基制成107/ml悬液，加cona使终浓度为5μg/ml。分种于96孔培养板，每孔0.1ml。按设定浓度加药，每孔0.1ml。37℃，5％co2中培养72h，终止前6h每孔加入3h－tdr 18.5 kbq。收集细胞，在β－闪烁计数器上测c/min值，以增殖百分率与对数浓度作图示量－效关系。
2.药物对正常人角质形成细胞增殖的抑制试验： 包皮标本剪成条状，以25％分散酶液处理，置4℃、16h。再置4℃、0.125％胰蛋白酶中45min。游离角质形成细胞后用角质形成细胞无血清培养基调整成5×105/ml悬液，接种于铺有ⅲ型酸性可溶性胶原的96孔培养板中，每孔0.2ml，37℃、5％co2中培养，每隔2d换液。第9d按设定浓度加药，每孔0.1ml。培养24h后每孔加3h－tdr 18.5 kbq。随后同以上淋巴细胞试验方法处理。
3.药物对hela细胞增殖的抑制试验：传代生长3d的hela细胞，0.3％胰蛋白酶消化，用rpmi 1640完全培养基调整为2×105/ml悬液，分种于96孔培养板，每孔0.1ml。按设定浓度加药。37℃，5％co2中培养24h，每孔加3h－tdr 18.5 kbq，同以上试验处理。
4.统计学处理：淋巴细胞和hela细胞增殖抑制试验结果用直线回归方程作相关系数的显著性检验，并计算药物抑制细胞增殖50％时的药物浓度，即ic50值。角质形成细胞增殖抑制试验结果因药物浓度点较少，未作直线方程处理，得目测ic50近似值。
结 果
1. 表1 结果显示，t0及cya在药理浓度下均显著抑制人pbmc的增殖，其ic50值分别为7.27×10－7μg/ml和4.59×10－3μg/ml, 表明t0及cya均为t淋巴细胞增殖的强抑制剂。直线回归方程：t0：y=－21.1333－11.5878x,r=－0.9712, n=10, p＜0.01。cya：y=17.666－13.8333x, r=－0.9924,n=8, p＜0.01。
表1 t0和cya诱导的外周血单一核细胞增值的抑制作用
样 品药物浓度
(μg/ml)
平均每分钟计数
(±s,c/min)
增值百分率(%)
t010-102698±904106
10-92062±481
10-81931±13276
10-71497±7358
10-61124±16444
10-5652±625
10-4414±4516
10-3215±858
10-2185±187
10-1143±55
无药对照-2538±20100
cya10-67162±195102
10-55340±4591
10-44969±8271
10-33726±4353
10-22895±1041
10-12498±8336
11575±1222
10202±32
无药对照-6998±744100
注：上述数据已减去本底．增殖百分率＝药物处理组/无药物处理组×100%
2.表2 结果显示，t0及对照药蒽林和细胞抑制剂鬼臼毒素在体外均能抑制生长于低钙角质形成细胞无血清培养基中的角质形成细胞增殖，目测ic50近似值分别为2×10－3μg/ml、7×100μg/ml和6×10－2μg/ml。而cya在药理浓度下无抑制作用，仅在10μg/ml浓度组有26％的抑制作用。
表2 t0和cya及对照药鬼臼毒素和蒽林在低钙角质形成细胞无血清培养基中对正常人角质形成细胞的抑制作用
样 品药物浓度
(μg/ml)
平均每分钟计数
(±s,c/min)
增值百分率(%)
t010-47841±560＊＊67
10-35968±656＊＊51
10-24330±229＊＊37
10-13393±169＊＊29
鬼臼毒素10-39128±132378
10-26553±1452＊＊56
10-15266±417＊＊45
无药对照-11703±447100
蒽 林17371±67287
103050±45＊＊36
cya10-18388±52299
17625±45996
106270±270＊＊74
无药对照-8473±351100
注：上述数据已减去本底 ＊p＜0.05．＊＊p＜0.01．增殖百分率＝药物处理组/无药物处理组×100%
3.表3结果显示，t0和鬼臼毒素能抑制生长加速的上皮细胞hela细胞的增殖，其ic50值分别为4.59×10－5μg/ml和6.1×10－3μg/ml，前者效价较后者高133倍。而cya在超出药理浓度下也未表现出对上皮细胞增殖的抑制作用。直线回归方程：t0：y=－6.8571－13.1071x,r=－0.9672,n=7,p＜ 0.01。鬼臼毒素：y=0.26－22.45x,r=－0.9401,n=5,p＜ 0.01。讨 论 研究结果显示，t0和cya都具备抑制t淋巴细胞增殖及dna合成的药效，与文献报道一致[4]，这是两药的共同点。在治疗银屑病时，本药效能降低，cd4＋t细胞异常激活，从而下调细胞因子表达。
表3 t0及cya及对照药鬼臼毒素对hela细胞增值的抑制作用
样 品药物浓度
(μg/ml)
平均每分钟计数
(±s,c/min)
增值百分率(%)
t010-732556±167578
10-629029±213870
10-526622±3319664
10-424618±414659
10-312910±204531
10-24377±71611
10-12387±5076
无药对照-41767±2210100
鬼臼毒素10-423618±153784
10-319243±107368
10-218337±53665
10-12140±9008
1572±4282
无药对照-28267±6034100
cya10-635427±366299
10-534162±442696
10-437417±1609105
10-337116±4951104
10-237316±196105
10-134208±282696
139462±4906110
1032081±377790
无药对照-35618±2761100
注：上述数据已减去本底．增殖百分率＝药物处理组/无药物处理组×100%
t0对上皮细胞增殖有直接抑制作用，而cya在药理浓度下未表现出抑制作用。结合文献资料可推断，cya对银屑病的药效主要不是对角质形成细胞的直接抑制作用，而是针对cd4＋t细胞及有关细胞因子，这是两药抗银屑病的主要区别。同时亦提示cya局部应用无效的主要原因可能不是药剂学问题，而是药效学决定的[5]。比较t0对淋巴细胞(ic50=7.27×10－7μg/ml)和上皮细胞(角质形成细胞 ic50≈2×10－3μg/ml, hela: ic50=4.59×10－5μg/ml)的作用效价可看出，在体外，t0对t淋巴细胞的作用要比对上皮细胞的作用强得多，提示利用药物作用选择性在量上的差别，通过药代动力学和临床给药方案的研究，将雷公藤有效成分的剂量和血药浓度调整为主要针对t淋巴细胞，以提高治疗指数是有可能和值得研究的。edward等报告用相当口服甲氨蝶呤有效低剂量的血药浓度在体外对处于增殖状态的人单核巨噬细胞(thp－1株)和人t细胞(molt－4株)产生的细胞毒作用比对人上皮癌细胞(hela株)和人表皮角质形成细胞传代细胞(hacat株)敏感10～100倍，比对原代正常人角质形成细胞敏感1000倍，提示有效低剂量的甲氨蝶呤治疗银屑病的主要作用靶位可能是单核－淋巴细胞[6]。雷公藤与甲氨蝶呤在治疗银屑病方面可能有相似之处。t0对上皮细胞增殖的抑制活性也是雷公藤制剂系统给药治疗有关疾病选择性不高及利/弊权衡的关键问题。此外，t0对角质形成细胞的直接作用亦为雷公藤有效成分局部应用治疗银屑病提供了可行性及重要的药效学依据。
已经证明，在体外培养下，银屑病患者累及、未累及皮肤的角质形成细胞与正常人皮肤角质形成细胞之间的参数很接近。而且，生长不活跃的细胞对细胞抑制药物的敏感性较低。如果把角质形成细胞体外培养法用于抗银屑病药物敏感性的筛选时会引起定量上的误导。本实验用hela细胞补充角质形成细胞的实验结果，作为检测药物对增殖加速的细胞抑制作用强度及安全判断的参考。
参考文献
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(收稿：1998－05－11 修回：1998－09－08)
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