凋亡调控蛋白在银屑病患者外周血淋巴细胞中的表达

2015-09-30 17:22:43

　　中华皮肤科杂志 1999年第2期第32卷短篇论著

　　作者：王继文　刘华昌　尹格平　孙晓明

　　单位：王继文　刘华昌　　250031 济南，济南军区总医院皮肤科；尹格平　孙晓明　　流式细胞室

　　有资料表明，淋巴细胞凋亡发生异常是导致免疫紊乱和一些疾病发生的重要原因[1]。我们应用流式细胞计数分析了凋亡调控蛋白apo-1、apo-2.7和bcl-2在银屑病患者外周血淋巴细胞(pblc)中的表达，旨在从凋亡的角度探讨银屑病的免疫发病机制。

　　一、病例和方法

　　(一)病例：寻常型银屑病患者30例，男26例，女4例；年龄21～56岁，平均33.3岁；病程1个月至15年，平均3年。所有患者均于治疗前后即进行期和缓解期各抽血1次，抽血前均以pasi给患者的病情程度计分[2]。健康对照20例，男17例，女3例；年龄20～52岁，平均35岁。

　　(二)实验方法：

　　1.试剂及来源：异硫氰酸荧光素标记的apo-1和bcl-2单克隆抗体(apo-1-fitc、bcl-2-fitc)及藻红蛋白标记的apo-2.7单克隆抗体(apo-2．7-pe)均由法国国际免疫公司生产；淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液学研究所生产。

　　2.样品处理：晨取肘静脉血2ml，2％ edta抗凝并悬浮于淋巴细胞分离液上，1500r/min离心15min，提取其中的淋巴细胞，加pbs 2ml漂洗，同速离心弃上清液，备用。

　　3.免疫反应：反应前调整细胞数至109/ml，分别取100μl样品放入3支试验管和3支对照管，试验管分别加20μl apo-1-fitc、bcl-2-fitc和apo-2．7-pe。对照管分别加20μl igg1-fitc、igg1-fitc和igg1-pe，室温避光反应30min，上机。

　　4.流式细胞检测：仪器为facscan型，美国becton-dickinson公司产品。上机前先用标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0％以内，上机后收集10000个细胞，荧光强度以对数放大，测定光散射数据，结果采用macintosh650型计算机及cell quest plot软件进行数据分析。

　　(三)统计学处理：两样本均数u检验，spearman等级相关分析。

　　二、结果

　　1.银屑病患者治疗前后即进行期和缓解期apo-1、apo-2.7、bcl-2在淋巴细胞上的表达水平：见表1。

　　表1　不同阶段银屑病患者外周血淋巴细胞apo-1、apo-2.7和bcl-2的表达水平(±s,%)

　　组　别例　数apo-1apo-2.7bcl-2

　　健康对照组200.53±0.240.90±0.6235.87±5.35

　　银屑病组

　　进行期305.59±2.86＊＊△9.37±4.54＊＊△2.98±2.19＊＊△△

　　缓解期302.74±1.91＊4.70±3.01＊13.33±4.72＊＊

　　注：与健康对照比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01；进行期与缓解期比较△p＜0.05，△△p＜0.01

　　2.相关分析显示：银屑病患者pblc对bcl-2的表达水平与pasi呈明显负相关(rs=－0.614,p＜0.01)，与病程无关；bcl-2与apo-1、apo-2．7亦呈负相关(rs值分别为－0.414、－0.443，p＜0.05)；apo-1与apo-2．7呈正相关(rs=0.434,p＜0.05)，二者在pblc上的表达均与pasi呈正相关(rs=0.435、0.412,p＜0.05)，而与病程不相关。

　　三、讨论

　　fas系统和bcl-2家族是调节淋巴细胞凋亡最重要的两类基因[3]，其表达产物apo-1、apo-2.7和bcl-2蛋白分布于淋巴细胞线粒体膜、内质网及细胞膜上，对淋巴细胞发育、分化、活化和清除有重要调节作用，是维护机体免疫自稳机制的基础[4，5]。其中apo-1和apo-2．7是促使淋巴细胞凋亡的蛋白，bcl-2则是凋亡抑制蛋白[5，6]。实验结果显示银屑病患者pblc表达bcl-2的水平明显低于对照组，经中药及uvn光等治疗后病情缓解，bcl-2水平也随之提高，但仍较对照组明显偏低，说明银屑病患者pblc的抗凋亡水平下降。同时，银屑病患者pblc的apo-1、apo-2．7水平均高于对照组，说明银屑病患者pblc凋亡基因的表达水平上调。pblc的凋亡基因过表达与抗凋亡基因失表达，两方面都使pblc对凋亡的易感性增加。

　　相关分析显示pblc表达bcl-2的水平与pasi计分呈显著负相关，apo-1和apo-2.7则与pasi呈正相关，提示银屑病患者病情越重，淋巴细胞的凋亡调控失衡越明显，pblc凋亡发生率越高。国内倪晓等[7]曾报道银屑病皮损中呈现大量角质形成细胞的凋亡形态，基底细胞表达bcl-2的水平亦明显低于正常，可见银屑病角质形成细胞的凋亡亦存在调控失衡现象。细胞的凋亡及其调节是一个十分复杂的过程，银屑病患者pblc和角质形成细胞凋亡之间的联系有待进一步研究。

　　参考文献

　　1　thompson cb. apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. science, 1995,267:1456－1462.

　　2　fredriksson t, petterson u. severe psoriasis-oral theraphy with a new retinoid. dermatologica, 1978,157:238－244.

　　3　mountz jd, talal n. retroviruses, apoptosis and autogenes. immunol today, 1993,14:532－536.

　　4　schwartz lm, osborne ba. programed cell death apoptosis and killer genes. immunol today, 1993,14:582－590.

　　5　zhang c, ao z, seth a, et al. a mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apopototic cells. j immunol, 1996,157:3980-3987.

　　6　kabelitz d, pohl t, pechhold k. activation-induced cell death (apoptosis) of mature perepheral t lymphocytes. immunol today, 1993,14:338－339.

　　7　倪晓，孙建方，杨海平，等. 银屑病皮损中细胞凋亡的原位标记检测与bcl-2的表达. 中华皮肤科杂志, 1998,31:95－96.

　　(收稿：1998－04－06 修回：1998－08－13)