8－甲氧补骨脂素对小鼠黑素瘤细胞黑素生成的调节及相关信号转导研究

2015-09-30 17:22:55

　　中华皮肤科杂志 1999年第2期第32卷论著

　　作者：雷铁池朱文元夏明玉张美华范卫新

　　单位：雷铁池　朱文元（指导者）　张美华　范卫新　　210029 南京，南京医科大学第一附属医院皮肤科；夏明玉（指导者）　　南京医科大学基础医学院电镜室[]

　　关键词：甲氧沙林；黑素类；信号传递

　　【摘　要】　目的　研究光化疗法中光敏剂8－甲氧补骨脂素(8－mop)在诱导白癜风色素减退皮损复色过程中所起的作用及其分子机制。方法　用体外培养的b16f10鼠黑素瘤细胞作模型，观察了不同浓度(10～500μmol/l)8－mop对b16f10细胞的形态、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响。结果　50或100μmol/l浓度的 8－mop处理细胞48h后，b16f10细胞的树状突明显增多延长，胞浆内出现较多的棕褐色颗粒。8－mop并能以浓度依赖方式提高酪氨酸酶活性和黑素含量，较对照组高2～3倍( p＜ 0.01 ), 且在50、100μmol/l浓度时这种作用呈现最强。此外还发现8－mop尚能浓度依赖地抑制细胞生长，100μmol/l时与对照组相比细胞抑制高达60％，500μmol/l时细胞几乎不能生长。用蛋白激酶a或c的激活剂，异丁基甲基黄嘌呤（ibmx）和佛波酯（tpa）与8－mop联合处理细胞发现8－mop诱导黑素生成作用能被ibmx加强，被长时程作用的tpa抑制。结论　8－mop能以浓度依赖方式提高酪氨酸酶活性和黑素含量,在体外直接诱导鼠黑素瘤细胞黑素生成，蛋白激酶a和蛋白激酶c信号途径参与8－mop诱导黑素生成作用的调节。

　　study on regulation of melanogenesis induced by 8-methoxypsoralen

　　and related signal transduction pathways

　　in murine melanoma cells

　　lei tiechi, zhu wenyuan, xia mingyu, et al.

　　department of dermatology, first affiliated hospital, nanjing medical university, nanjing 210029

　　【abstract】　objective　to get more insight on the molecular mechanisms involved in psoralen-induced melanogenesis during repigmentation of the hypomelanotic lesions of vitiligo vulgaris under puva treatment.methods　the effects of various concentrations of 8-methoxypsoralen (8-mop)(10～500μmol/l) upon cellular morphologic changes, tyrosinase activity, and melanin contents of cultured b16f10 murine melanoma cells were examined in vitro.results　8-mop caused a striking change in cellular morphology with many elongate cell dendrites and deposits of brown granular materials in cytoplasm, these effects were observed clearly at final concentrations between 50 and 100μmol/l of 8-mop after treating for 48 hours. in a range of final concentrations(10～500μmol/l), there were a dose-dependent stimulation of tyrosinase activity and melanin contents with a 2～3 fold increase over untreated cells ( p＜ 0.01 ), the maximum action was obtained at 50 and 100μmol/l. it was also found that there was a dose-related inhibition of cell growth with a 60％ reduction of growth at a final concentration of 100μmol/l and no growth of cells at the concentration of 500μmol/l. furthermore, isobutyl methylxanthine(ibmx), a protein kinase a (pka) activator, potentiated the 8-mop upregulation of tyrosinase activity and melanin contents, however, 12-o tetradecanoyl phorbol 13-acetate (tpa),a potent activator of pkc, inhibited the upregulative effect of 8-mop when treated for a long duration.conclusion these results demonstrate that in murine melanoma cells 8-mop could induce melanogenesis by increasing tyrosinase activity and melanin contents. at least, pka and pkc－dependent signaling pathways appear to play an important role in the melanogenic effect of 8-mop.

　　【key words】　methoxsalen　　melanin　　signal transduction

　　8－甲氧补骨脂素(8-mop)是一种呋喃香豆素类光敏物。内服或外用8-mop结合长波紫外线照射(puva)能使白癜风色素减退皮损复色(repigmentation)[1]。其作用机理至今还不清楚。我们用体外培养的b16f10鼠黑素瘤细胞作模型，观察不同浓度8-mop对b16f10细胞的形态、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响，同时用蛋白激酶a（pka）和蛋白激酶c（pkc）激活剂或抑制剂工具药来研究与8-mop诱导黑素生成相关的信号转导途径，目的是研究8-mop诱导调节黑素生成的分子机制，探讨其在临床治疗白癜风色素减退皮损复色过程中所起的作用。

　　材料和方法

　　1．试剂和材料：rpmi 1640 培养基（gibco）, 脱氧胆酸钠（serva）,hepes(farco) 12－o－十四烷酰佛波醇－13－醋酸酯(tpa)、异丁基甲基黄嘌呤（ibmx）、左旋多巴（l-dopa）、二甲基亚砜（dmso）、胰蛋白酶（sigma产品），新生小牛血清（ncs）（南京医科大学寄生虫分子生物学研究室提供），8-mop（江苏溧阳市制药厂），分光光度计（上海第三分析仪器厂）。

　　2．b16f10细胞培养：b16f10鼠黑素瘤细胞株由日本日星r＆d beauty care公司hideya ando博士惠赠。将引进的细胞株冷冻在液氮内保株。传代时取指数生长期的b16f10细胞，待生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶和edta 0.02％消化，用含有10％ncs的rpmi 1640培养基传代，置co2孵箱常规进行培养。每1次实验均取自同一传代细胞，根据实验设计要求和培养瓶规格选定细胞初始接种浓度为5000个/cm2左右。细胞接种24h后，用添加药物的新鲜培养基换液1次。继续孵育72h后收获细胞，用台盼蓝排斥法计数活细胞数，随后将细胞分为2份分别用于酪氨酸酶活性和黑素含量测定。

　　3．药物处理及实验分组：8-mop、tpa和ibmx贮液用dmso新鲜配制，避光保存在－20 ℃冰箱2周内使用。临用时用新鲜培养基调至终浓度。实验设定8-mop终浓度分别为10、50、100、500μmol/l。tpa和ibmx的处理浓度按文献定为tpa（100nmol/l）[2], ibmx(200μmol/l)[3]。实验分组：8-mop组，tpa组，ibmx组，8-mop＋tpa组,8-mop＋ibmx组。空白对照组仅加入溶媒dmso。

　　4．酪氨酸酶活性测定：参照ando等[4]报道的方法并稍加改良。收获大约107细胞,离心后用冷pbs洗涤2次。加入0.5％脱氧胆酸钠裂解细胞,制备含有活性酪氨酸酶的细胞裂解物。测定酶活性时，将细胞裂解物一式3份分别加入到含0.1％ l-dopa的0.1mol/l pbs(ph 6.8)反应液中,用分光光度计在475nm测定反应起始5 min的a475值。测定酶活性的整个过程均在37℃进行，同时用l-dopa的自动氧化进行校正。酪氨酸酶活性用每个细胞加药处理组a475值占空白对照组a475值的百分率来表示。每一处理因素重复测定3次。

　　5．黑素含量测定[4]：收获大约107细胞,离心后用pbs洗涤2次。加入1 mol/l naoh,置80℃ 30 min水浴中使细胞团块完全溶解。并用双蒸水将naoh的终浓度稀释至0.2 mol/l。用分光光度计在400nm测定a400值。黑素含量用每个细胞加药处理组a400值占空白对照组a400值的百分率来表示。每一处理因素重复测定3次。

　　6．数据处理：所测实验数据采用配对计量资料t检验。统计过程使用stanford-plot 医学统计软件完成。

　　结　果

　　（一）8-mop对b16f10细胞形态的影响：传代培养的b16f10细胞主要为两极,偶见三极的贴壁生长上皮型细胞，只有经多巴染色后才能在细胞浆内观察到多巴染色阳性的褐色颗粒存在（图1）。当细胞经50μmol/l或100μmol/l 8-mop作用48 h后，即能发现细胞树状突明显增多并延长，胞浆和树状突内出现大量棕褐色颗粒，72 h后观察这些形态变化更加明显（图2）。

　　图1　b16f10细胞主要为两极，偶见三极的贴壁生长上皮型细胞，经多巴染色后在细胞浆内可见到多巴染色阳性的褐色颗粒(×400)

　　图2　b16f10细胞经50μmol/l 8-mop作用48h后，见细胞树状突明显增多并延长，胞浆和树状突内未经多巴染色也可见到大量棕褐色颗粒(×200)

　　（二）不同浓度8-mop对b16f10细胞的细胞计数，酪氨酸酶活性和黑素含量的影响：4种浓度（10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、500μmol/l）8－mop作用72 h后所测结果见表1。细胞计数与对照组相比明显减少,且呈浓度依赖性。100μmol/l时细胞计数较对照组减少达60％，500μmol/l时细胞几乎不能生长。8-mop并能以浓度依赖方式提高酪氨酸酶活性和黑素含量，较对照组高2～3倍(p＜0.01 ), 且在50μmol/l、100μmol/l浓度时这种作用呈现最强。50μmol/l 8-mop对酪氨酸酶活性的刺激作用与100μmol/l相比无统计学差异(t=0.0453,p＞0.05),但细胞计数比较100μmol/l明显少于50μmol/l (t=4.8366, p＜0.01)。因50μmol/l8-mop诱导黑素生成作用强，抑制细胞生长作用较弱，故以下实验选定50μmol/l 8-mop为理想处理浓度。

　　表1　不同浓度8-mop对黑素瘤细胞的细胞数，酪氨酸酶活性和黑素含量的影响(±s)

　　药物浓度(μmol/l)细胞计数(×106个)酪氨酸酶活性(%)黑素含量(%)

　　空白对照6.63±0.26(4)100.00(3)100.00(3)

　　107.28±0.06(4)101.72±0.49(3)108.00±8.18(3)

　　504.48±0.37(8)＊261.69±30.96(6)＊＊323.91±40.39(6)＊

　　1002.28±0.53(4)260.24±26.89(3)180.67±59.18(3)

　　5000.10±0.04(4)ndnd

　　注：酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组a值的百分率表示．括号内数字为测定次数．nd：未测出．50μmol/l组与100μmol/l组相比＊p＜0.01,＊＊p＞0.05

　　（三）tpa、ibmx对8-mop诱导的酪氨酸酶活性和黑素含量的调节：结果见表2。单独添加50μmol/l 8-mop、100nmol/l tpa、 200μmol/l ibmx处理细胞所测的酪氨酸酶活性和黑素含量与对照组相比均明显增加(p＜0.01),且以ibmx作用最强,8-mop次之,tpa仅有轻度刺激作用。当8-mop与tpa联合处理细胞时所测的酪氨酸酶活性(t=2.2001, p＞0.05)和黑素含量(t=1.0255, p＞0.05)与单独添加tpa时相比无统计学差异，8-mop的诱导作用被tpa抑制。相反，当8-mop与ibmx联合处理细胞时所测的酪氨酸酶活性(t=11.275, p＜ 0.01)和黑素含量(t=16.609, p＜ 0.01)却与单独添加8-mop时相比显著增加，8-mop的诱导作用被ibmx增强。

　　表2　tpa,ibmx对8-mop诱导的鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的调节(±s%)

　　处理分组酪氨酸酶活性黑素含量

　　空白对照100.00100.00

　　8-mop261.69±30.96(6)323.91±40.39(6)

　　tpa166.89±23.80(3)122.21±8.59(3)

　　ibmx445.23±68.13(3)869.86±60.69(3)

　　8-mop+tpa163.95±20.31(3)＊126.77±8.92(3)＊

　　8-mop+ibmx713.93±89.31(3)＊＊1016.25±95.06(3)＊＊

　　注：酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组a值的百分率表示．括号内数字为测定次数．＊与tpa组相比p＞0.05,＊＊与8-mop组相比p＜0.01

　　讨　论

　　光敏物8-mop在光化疗法中呈现出抑制角质形成细胞增殖和增强皮肤着色(pigmentation)两种不同的生物学效应。前者很可能是通过光活化补骨脂(photoactivated psoralen)与角质形成细胞dna 发生烷基化使dna复制受阻，但后者诱导黑素生成的机制至今仍不清楚[1，5]。有人推测在黑素细胞(mc)表面很可能存在有与8-mop特异性结合的补骨脂受体,8-mop能直接刺激mc诱导黑素产生[1]。为了证实这一观点，我们用体外培养的b16f10鼠黑素瘤细胞作模型，观察了不同浓度8-mop对b16f10细胞的形态、酪氨酸酶活性和黑素量的影响。结果发现50μmol/l或100μmol/l浓度的 8-mop处理细胞48h后，b16f10细胞的树状突明显增多延长，胞浆内出现较多的棕褐色颗粒。8-mop并能以浓度依赖方式提高酪氨酸酶活性和黑素量，较对照组高2～3倍, 且在50μmol/l、100μmol/l浓度时这种作用最强。从表1还能发现8-mop尚能浓度依赖地抑制细胞生长，100μmol/l时细胞计数较对照组减少达60％，500μmol/l时细胞几乎不能生长。8-mop这种抑制细胞生长作用很可能阻滞了部分细胞的生长周期(主要是g2期),但并不影响其对黑素生成的诱导[1，5]。

　　实验中我们还设计用蛋白激酶a或c的激活剂工具药ibmx和tpa与8-mop联合处理细胞以研究与8-mop诱导黑素生成作用相关的信号转导途径,发现8-mop诱导黑素生成作用能被ibmx加强。ibmx上调8-mop诱导作用很可能是通过camp/pka途径实现调节的。ibmx为磷酸二脂酶抑制剂，能显著提高细胞内camp水平[3]，而8-mop本身也能一定程度提高细胞内camp水平[1，5]，二者联合处理细胞时使胞内camp水平大大提高，继而活化pka加强了8-mop对黑素生成的诱导。相反8-mop这种诱导作用却能被长时程作用的tpa抑制。friedmann等[6]同样也观察到当向培养基中添加tpa时，uv照射人mc和s91细胞诱导黑素生成作用将被阻滞。tpa与信号分子二酯酰甘油（dag）结构类似，被认为是pkc的强激活剂[2，4，6]。但tpa处理细胞时间长短对pkc产生的作用却截然不同。有人用100nmol/l tpa处理培养的心肌细胞20 min发现细胞膜pkc活性明显升高，细胞质pkc活性显著下降；处理24h后发现细胞膜和细胞质pkc活性均下降[2]。tpa长时程处理细胞所产生的pkc活性抑制实质上是pkc活化不断地由胞质向胞膜发生转位(translocation)，接着活化的pkc被膜蛋白水解酶降解，胞内pkc耗竭，最终导致dag/pkc信号途径阻抑[1，2，6]。由此看来8-mop诱导黑素生成作用能被tpa长时程处理细胞所抑制与dag/pkc途径参与调节密切相关。我们还发现tpa单独并不能刺激黑素生成，它所引起的轻度酪氨酸酶活性和黑素含量增加很可能与提高细胞的基础黑素生成(basal melanogenesis)水平有关[6]。

　　临床很早注意到经puva治疗的白癜风皮损区色素重获首先是从毛囊周围开始的[7]。已有研究证实白癜风皮损区mc可能已遭到破坏甚至完全丢失，但毛囊外毛根鞘未活化mc并不受到影响[7]。8-mop除了直接刺激mc黑素生成外是否还能通过刺激毛囊外毛根鞘未活化mc增殖并向白斑区皮肤移行来参与白斑区复色,有待进一步研究证实。

　　国家自然科学基金资助项目(基金编号39570658、39870701)

　　参考文献

　　1　mengeaud v, ortonne jp. regulation of melanogenesis induced by 5-methoxypsoralen without ultraviolet light in murine melanoma cells. pigment cell res, 1994,7:245－254.

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　　3　bessou s, pain c, taieb a. use of human skin reconstructs in the study of pigment modifiers. arch dermatol, 1997,133:331－336.

　　4　ando h, itoh a, mishima y, et al. correlation between the number of melanosomes, tyrosinase mrna levels, and tyrosinase activity in cultured murine melanoma cells in response to various melanogenesis regulatory agents. j cell physiol, 1995,163:608－614.

　　5　marwan mm, jiang jw, de lauro castrucci am, et al. psoralens stimulate mouse melanocyte and melanoma tyrosinase activity in the absence of ultraviolet light. pigment cell res, 1990,3:214－221.

　　6　friedmann ps, wren fe, mattews jns. ultraviolet stimulated melanogenesis by human melanocytes is augmented by diacyl glycerol but not tpa. j cell physiol, 1990,142:334－341.

　　7　kovacs so. vitiligo. j am acad dermatol,1998,38:647－666.

　　(收稿：1998－03－09　　修回：1998－09－29)