原位杂交方法研究整合素α5、β1在硬皮病的表达

2015-09-30 17:22:56

　　中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷短篇论著

　　作者：洪微　廖万清　孔宪涛　李志刚

　　单位：洪微　廖万清　孔宪涛　李志刚（200003 上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科、临床免疫中心）

　　硬皮病时以胶原为主的细胞外基质(ecm)合成异常增多的病理机制仍不清楚。真皮成纤维细胞(fb)是合成ecm的主要细胞，研究发现硬皮病局部存在着高产量胶原和其他ecm的异常fb亚群，但这种异常亚群的激活机制及其表面分化抗原的特征均不清楚。近年来，发现ecm-细胞间作用对调控细胞的迁移、趋化性、增殖、分化和特异性基因的表达具重要作用；而介导ecm-细胞间作用的最主要受体是粘附分子整合素家族，研究其在硬皮病中的表达特征对揭示硬皮病ecm合成过多的病理机制具有重要意义。我们运用原位杂交方法研究了整合素α5、β1亚基在20例硬皮病皮损区的表达情况，并与非皮损部位及正常人皮肤进行比较。

　　一、材料与方法

　　1.病例：硬皮病患者20例，为1995年1月至1996年12月在本院皮肤科就诊的患者，均经临床及病理所证实，其中男7例，女13例；年龄9～46岁，平均年龄27.6岁；病程2～16个月不等；其中2例局限性硬皮病，18例系统性硬皮病。正常人皮肤对照20例，男8例，女12例；年龄12～40岁，平均25.2岁，均为本院外科手术的非皮肤病患者。标本离体后半小时内液氮速冻，oct包埋，－20℃恒温连续切片(7～8μm)，4％多聚甲醛固定，梯度酒精脱水后，－70℃保存。

　　2.主要试剂：整合素α5、β1亚基质粒由美国human genome sciences, inc倪健博士惠赠。限制性内切酶ecorⅰ、xhoⅰ及rna酶购自华美生物技术公司。鲑鱼精dna、多聚蔗糖、pvp、牛血清白蛋白、硫酸葡聚糖、depc为华顺生物技术公司产品。预杂交液配方参见文献[1]。杂交液为预杂交液中加入相应探针。地高辛标记试剂盒为boehringer mannheim公司产品。

　　3.探针制备及标记：整合素α5、β1质粒的转化、鉴定、扩增、抽提及回收均参照文献[2]，其序列长度分别为628bp、1020bp。探针标记采用地高辛试剂盒进行标记(随机引物法)；并依据点杂交方法估计地高辛标记探针的量：α5探针为3ng/μl，β1探针为5ng/μl。

　　4.原位杂交：详细步骤参见文献[1]。其中蛋白酶k浓度为2μg/ml，经预杂交、杂交后，参照地高辛标记试剂盒说明书，加入标记生物素的抗地高辛抗体，进行显色反应→梯度酒清脱水→透明封片，显微镜下观察结果，棕黄色或褐色为阳性。

　　二、结果

　　在真皮乳头层及真皮下层整合素α5或β1表达阳性的细胞呈散在或灶状分布。皮损部位阳性细胞明显多于非皮损部位及正常皮肤。此外，在表皮、真皮的细胞间也可见整合素α5、β1分布。在放大10×40倍光镜下，对每一标本任取5个不同的视野，在装有10×10的网格目镜测微器下计数每一方格(1cm×1cm)中fb平均阳性细胞数(阳性细胞密度)；所得结果用t检验进行统计学分析。结果表明硬皮病皮损α5、β1亚基mrna表达较非皮损区及正常人皮肤均显著增高。见表1。

　　表1　硬皮病患者皮损、非皮损及正常人皮肤整合素α5、β1

　　亚基表达的阳性细胞密度（±）

　　分组例数整合素α5整合素β1

　　阳性细胞浓度t值*p值阳性细胞浓度t值*p值

　　硬皮病皮损组2066.2±8.56.868〈0.0176.0±9.86.777〈0.01

　　硬皮病非皮损组2016.2±2.03.967〈0.0118.5±2.12.065〈0.05

　　正常人组207.5±0.9--9.0±1.3--

　　注：皮损与非皮损组比较α5亚基：t值=5.762，β1亚基：t值=5.739，p值均〈0.01

　　＊：与正常人组比较

　　三、讨论

　　硬皮病时ecm各成分发生了变化，而fb又是合成ecm的主要细胞，因此ecm-fb间相互作用在硬皮病的病理过程中尤为重要。本实验运用原位杂交技术检测到硬皮病皮损及非皮损区表皮及真皮α5、β1亚基mrna均有表达，真皮fb表面α5、β1亚基mrna表达较非皮损区及正常皮肤均显著增高，提示纤维粘连蛋白(fn)与fb间粘附作用在硬皮病时增强。整合素α5、β1亚基作为连接fn与fb细胞内骨架成分的桥梁，其表达增多将通过细胞骨架成分的作用影响着fb的诸多生物学功能，最直接的效应就是细胞骨架微管微丝收缩而导致fb游走，即对fb产生了趋化作用[3]； fn对fb的趋化作用区即是fn与fb发生粘附的结合区。而趋化作用可能是硬皮病fb高产量胶原异常亚群激活的可能机制[4]，这些作用可能涉及到整合素的细胞内信号传导途径[5]。

　　国家自然科学基金资助

　　参　考　文　献

　　[1] 苏慧慈. 原位杂交. 第1版.北京: 科学技术出版社,1994.73-74，147-149．

　　[2] j.萨姆布克, e.f.弗里奇, j.爱尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 金冬雁, 等译.第2版. 北京:科学技术出版社, 1992.23-26，55．

　　[3] lin cq， bissel mj. multi-faced regulation of cell differentiation by extracelluar matrix. faseb j, 1993,7:737-747.

　　[4] leroy ec, kahaleh mb, mercurio s. a fibroblast mitogen present in scleroderma but not control sera: inhibition by proteinase inhititors. rheumatol int, 1983,3:35-39.

　　[5] clark ea， brugge js. integrins and signal transduction pathways: the road taken. science, 1995,268:233-239.

　　(收稿：1998－04－06　　修回：1998－12－03）