系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞bcl-2的表达及临床意义

2015-09-30 17:23:00

　　中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷论　著

　　作者：刘亚光　尹培达　石成钢　赵湘茹　孔庆瑜　黄必军

　　单位：刘亚光、尹培达、石成钢、孔庆瑜(510080 广州，中山医科大学附属第一医院风湿科)；赵湘茹(教学实验中心)；黄必军(肿瘤研究所)

　　关键词：红斑狼疮；系统性；细胞死亡；bcl-2

　　【摘要】　目的　为了探讨bcl-2基因在系统性红斑狼疮(sle)发病机制中的作用及临床意义。方法　应用逆转录－聚合酶链反应(rt-pcr)检测31例sle患者外周血单一核细胞(pbmc) bcl-2 mrna表达水平和流式细胞仪双标记法分析其t、b细胞bcl-2蛋白表达。结果　活动期sle患者pbmc bcl-2 mrna表达水平明显升高，占55.6％，且活动期sle患者cd3＋、cd4＋和cd8＋t细胞亚群bcl-2蛋白表达明显高于非活动期sle患者、正常人对照组和其他疾病组，而cd19＋b细胞bcl-2蛋白表达在各组之间并无统计学差异。结论　t细胞bcl-2异常表达在sle疾病活动的过程中起着重要作用，检测sle患者外周血t淋巴细胞bcl-2的表达水平可作为sle的活动性指标。

　　expression of bcl-2 in lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus and its clinical significance

　　liu yaguang, yin peida,shi chenggang,et al. division of rheumatology,kidney institute,first affiliated hospital, sun yat-sen university of medical sciences,guangzhou 510080

　　【abstract】　objective 　to investigate the role of bcl-2 expression in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (sle) and its clinical significance.methods　the bcl-2 mrna levels in peripheral blood mononuclear cells (pbmc) from 31 sle patients were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction (rt-pcr), and the bcl-2 protein levels in t and b cells were also tested by two-colour cytofluorography.results bcl-2 mrna levels in pbmc increased significantly in 10 cases of active sle, accounting for 55.6％ of active sle patients. compared with those in inactive sle patients, normal controls and other non-sle patients, the bcl-2 protein expression in t cell subsets (including cd3＋, cd4＋ and cd8＋) increased significantly in active sle patients. however, there was no statistical difference in bcl-2 protein levels in cd19＋ b cells among all groups.conclusion　the abnormal expression of apoptosis-related bcl-2 in t cells might play an important role in disease activity of sle , and the determination of bcl-2 expression levels of peripheral t lymphocytes might be used as an index for disease activity of sle.

　　【key words】 lupus erythematosus,systemic 　　apoptosis　　bcl－2

　　bcl-2基因是人们在研究b细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂21.3(18q21.3)[1]。近年发现，bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因，bcl-2转基因鼠自身反应性b细胞克隆消除功能抑制，b细胞记忆和生存期均延长，可产生许多自身抗体，形成sle样病损，因而有人称之为自身免疫基因[2]。为此，我们检测了sle患者外周血单一核细胞(pbmc)bcl-2表达水平。

　　病例和方法

　　(一)对象：31例住院和门诊病例均符合1982年美国风湿病协会sle分类修订标准。其中女26例，平均年龄31±8岁(18～58岁)。几乎所有患者在受检时均用过泼尼松10～30mg/d。参照唐福林等[3]标准按受检时临床及实验室检查结果分为活动期和非活动期，活动期18例，非活动期13例。设其他疾病组9例(类风湿关节炎和慢性肾炎各3例，强直性脊柱炎、多发性肌炎和白塞病各1例)。正常人对照组14例系健康人员，女10例，平均年龄33±9岁(21～59岁)。

　　(二)方法：

　　1.pbmc分离：采用分层液密度梯度离心获取pbmc。

　　2.pbmc bcl-2 mrna测定[4]：根据chomczynski的一步法提取总rna，以0.5％ sds于－80℃保存备用。以逆转录－聚合酶链反应(rt-pcr)测定bcl-2的mrna表达水平。cdna合成总体积为20μl：rna模板2μl(2μg)，25mmol/l mgcl2 0.8μl，amv缓冲液4μl，10mmol/l dntp 1μl，oligo(dt)1.5μl，amv-rtase 1μl，depc h2o 10.7μl，42℃孵育1h，95℃ 5min终止反应。参照文献[4]在加拿大真达生物技术公司合成引物，bcl-2正义引物=5′-cgacgacttctcccgccgctaccgc-3′，反义引物=5′-ccgcatgctggggccgtacagttcc-3′；扩增产物范围318bp。内对照β-肌动蛋白正义引物=5′-gtggggcgcccaggcacca-3′，反义引物=5′-ctccttaatgtcacgcacgatttc-3′，扩增产物范围548bp。按以下配方进行pcr，即cdna模板5μl,10mmol/l dntp 5μl，10×缓冲液(100mmol/l tris/hcl ph8.2 25mmol/l mgcl2 0.01％明胶)5μl,50pmol/l引物各1μl，taq dna聚合酶3u(1.5μl)(promega)，补足双蒸水至总体积50μl，混匀。在pe 9600型扩增仪上进行循环，95℃预变性5min后，加入taq酶，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环，72℃充分延伸7min。产物4℃备用。取15μl pcr产物，作1.5％的琼脂糖凝胶电泳，以pbr322/bstnⅰ 8μl作分子量标记，溴化乙锭染色并在紫外线透照仪上观察dna电泳带结果。

　　3.t、b淋巴细胞bcl-2蛋白表达的检测[4，5]：以流式细胞仪双标记免疫荧光方法测定外周血t、b淋巴细胞bcl-2蛋白的表达。pbmc加入多聚甲醛使其终浓度为0.5％，4℃过夜后离心弃上清液，加入0.1％的triton100 5min离心弃上清液，每管分别加入fitc标记的鼠抗人cd3、cd4、cd8和cd19单抗(igg1)(immunotech)10μl，再加入兔抗人bcl-2多抗(dako)5μl，混合后4℃ 60min，pbs洗2遍，所有管都加入若丹明标记的羊抗兔igg(immunotech)5μl，混合后4℃ 60min，以流式细胞仪(coulter)分析每管样品中10 000个细胞得出表达bcl-2蛋白阳性的百分率。

　　(三)统计分析：应用美国spss 6.0对实验数据进行mann-whitney u检验。

　　结　　果

　　结果显示，活动期sle患者pbmc bcl-2 mrna表达明显升高者10例，占55.6％，而非活动期sle、其他疾病组和正常人对照组pbmc bcl-2 mrna表达水平未见明显增加。进一步分析发现，活动期sle患者cd3＋、cd4＋和cd8＋t细胞亚群bcl-2蛋白表达明显高于非活动期sle、其他疾病组和正常人对照组(p＜0.01)，而cd19＋b细胞bcl-2蛋白的表达在sle活动期与非活动期及正常人对照组、其他疾病组之间无统计学差异(p ＞0.05)。同时cd3＋、cd4＋和cd8＋t细胞亚群bcl-2蛋白表达阳性率在非活动期sle、其他疾病组和正常人对照组之间也无显著性差异(p＞0.05)(见表1)。

　　表1　sle患者t细胞亚群和b细胞bcl-2蛋白表达（±s%）

　　组别例数cd3cd4cd8cd19

　　活动期sle1863.49±16.7764.32±16.2960.76±16.9278.23±11.50

　　非活动期sle1314.52±10.9314.07±11.7015.93±11.5680.56±10.48

　　其他疾病组911.47±4.9712.44±5.7711.00±4.9878.59±7.52

　　正常人对照组149.94±4.9614.99±20.9210.53±4.8981.91±6.97

　　讨　　论

　　sle是一种全身性多器官的自身免疫病，免疫学特征是b细胞多克隆化，t细胞活化增加，产生许多自身抗体。其发病机制尚不清楚。有人报道活动期sle患者t细胞bcl-2蛋白表达明显增高[5，6]，且pbmc bcl-2 mrna表达水平明显升高[7]，我们也证实活动期sle患者t细胞bcl-2蛋白和pbmc bcl-2 mrna表达均显著增加，与非活动期sle患者有显著性差异。strasser等[8]观察到细胞凋亡抑制基因bcl-2对成熟t细胞具有明显效应，可表达bcl-2的外周血t细胞在培养中不仅生存较长，而且也产生持续时间长而剧烈的抗原反应。这种抗原反应的变化可能是活化t细胞凋亡被抑制的结果。另外，我们发现cd4＋t细胞(t辅助细胞)和cd8＋t细胞(t抑制细胞)亚群bcl-2表达异常，这可导致t细胞亚群凋亡的异常，从而引起sle患者t细胞的免疫调节功能紊乱，而sle患者b细胞的活化是t细胞依赖性的，在b细胞多克隆化过程中，t细胞调节功能紊乱是一个重要因素。表明t细胞bcl-2异常表达在sle疾病活动的过程中起着重要作用，检测sle患者血t淋巴细胞bcl-2的表达水平可作为sle的活动性指标。

　　国家自然科学基金资助(39770706)

　　参　考　文　献

　　[1] tsujimoto t, finger lr, yunis j, et al. cloning the chromosome breakpoint of neoplastic b-cells with the t(14;18) chromosome translocation. science, 1984,226:1097-1099.

　　[2] talal n. concluding remarks: autogenes and oncogenes. clin immunol immunopathol, 1994,72:208-209.

　　[3] 唐福林, 董怡, 陈培珍, 等. 系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎病人血清中抗组蛋白抗体的测定及其临床意义. 中华内科杂志, 1990,29:221-223.

　　[4] tu y, xu f, liu j, et al. upregulated expression of bcl-2 in multiple myeloma cells induced by exposure to doxorubincin, etoposide, and hydrogen peroxide. blood, 1996,88:1805-1812.

　　[5] ohsako s, hara m, harigai m, et al. expression and function of fas antigen and bcl-2 in human systemic lupus erythematosus lymphocytes. clin immunol immunopathol, 1994,73:109-114.

　　[6] aringer m, wintersberger w, steiner cw, et al. high levels of bcl-2 protein in circulating t lymphocytes, but not b lymphocytes, of patients with systemic lupus erythematosus. arthritis rheum, 1994,37:1423-1430.

　　[7] graninger wb. transcriptional overexpression of the protooncogene bcl-2 in patients with systemic lupus erythematosus. wien wlin wochenschr, 1992,104:205-207.

　　[8] strasser a, harris aw, cory sb. bcl-2 transgene inhibits t cell death and perturbs thymic self-censorship. cell, 1991,67:889-899.

　　(收稿：1997－10－16　　修回：1998－05－11）