细胞毒T细胞识别皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体个体基因型肽抗原

2015-09-30 17:23:01

　　细胞毒t细胞识别皮肤t细胞淋巴瘤的t细胞受体个体基因型肽抗原

　　中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷论　著

　　作者：丁铁钢　邱丙森　lynda tyrell　　jack longley

　　单位：丁铁钢　lynda tyrell　jacklongley(美国耶鲁大学医学院皮肤科)；邱丙森(上海医科大学皮肤病学研究所)

　　关键词：淋巴瘤；t细胞；皮肤；受体；抗原；t细胞

　　【摘要】　目的　确定细胞毒t细胞是否能识别由第三互补决定区特异基因编码的肽。方法　选择两例皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)患者(ss和ar)的cd4＋、vβ8＋恶性t细胞作为测定肽序列的细胞，cd8＋非恶性t细胞作为杀伤或反应性细胞，和转化的淋巴母细胞样细胞作为主要组织相容性复合体(mhc)抗原提呈的细胞。结果　患者ss的恶性t细胞的t细胞受体(tcr)β链的个体基因型肽可刺激cd8＋t细胞产生肿瘤坏死因子(tnf)-α，但患者ar的mtc的tcr蛋白的个体基因型区的对照肽则不刺激产生tnf-α。反之，患者ar的cd8＋t细胞藉分泌tnf-α而对自身肽应答，但对来源于对照患者ss和人类免疫缺陷病毒感染患者的其他肽不应答。结论　细胞毒t细胞对ctcl的淋巴细胞个体恶性克隆独特的特殊的mhcⅰ类相关肽的识别和应答具有特异性，确定ctcl的肿瘤特异性定位，可进一步为能够激发对肿瘤细胞的cd8＋t细胞参与的免疫应答的疫苗研制和治疗提供新线索。

　　recognition of cutaneous t cell lymphoma t cell receptor idiotypic peptide antigens by cytotoxic t cells

　　ding tiegang＊, qiu bingsen＊＊, lynda tyrell, et al. ＊department of dermatology, medical college, yale university usa, ＊＊department of dermatology, huashan hospital, shanghai medical university, shanghai 200040

　　【abstract】　objective　to determine whether cytotoxic t cells could recognize the peptides encoded by specific gene of the third complementary determining regions(cdr3).methods　the cells separated from two patients with cutaneous t cell lymphoma(ctcl) (ss and ar) cd4＋.vβ 8＋ malignant t cells(mtc) were used as peptide sequence determining cells, cd8＋ non-malignant t cells as killer cells or reactive cells, and transformed lymphoblastoid cells as major histocompatibility complex(mhc) antigen presenting cells.results the idiotypic peptide from patient ss's tcrβ chain of mtc could stimulate tumor necrotizing factor (tnf)-α production by autologous cd8＋ t cells. tnf-α production was not stimulated by a control peptide derived from the idiotypic region of patient ar's tcr protein of mtc. in contrast, the cd8＋ t cells of patient ar responded to autologous peptide by secreting tnf-α, but did not respond to other peptides derived from the control patient ss and patients with hiv infection.conclusion　cytotoxic t cells may recognize and respond to a specific mhc class i associated peptide unique to individual malignant clones of lymphocytes in ctcl. the identification of a tumor-specific epitope in this disease may permit the development of vaccines that could boost or initiate the cd8＋ t cells-mediated immune response to the tumor cells.

　　【key words】 lymphoma,t-cell,cutaneous　　receptors,antigen,t-cell

　　皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)是一种cd4＋t细胞性恶性淋巴瘤。瘤细胞开始浸润皮肤但往往累及血液、淋巴样器官和内脏。heald等[1]发现一组晚期ctcl患者经光细胞分离法(photopheresis)治疗缓解后，血循环中cd8＋细胞的数目接近正常。ctcl的预后[2]通常与皮肤损害中主要组织相容性复合体(mhc)ⅰ 类分子、活化的cd8＋细胞毒t细胞(ctc)相关。在体外，从ctcl患者分离出的cd8＋ctc可选择性地溶解自身恶性t细胞(mtc)[3]。因cd8＋t细胞识别由mhcⅰ类分子提呈的肽抗原，我们探索能够提供这种肽的肿瘤特异性蛋白。t细胞抗原受体(tcr)是由α和β链组成的一种异二聚体，因此，tcr链是肿瘤特异性肽的一种理想的可能来源。每个tcr链含有称之为互补决定区(cdr)的变(v)区，因这些v区与mhc抗原复合体部分起互补和直接相互作用。每个链的高变区称为cdr3或个体基因型(idiotypic, it)区，直接与mhc分子结合的肽抗原相互作用，并决定tcr的抗原特异性。从理论上，来源于cdr3的肽可由t细胞的mhcⅰ类分子显示并由其他t细胞识别。我们设想，按照it序列编码的肽抗原可作为细胞溶解性t淋巴细胞的靶对象，可研究cd8＋t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用和免疫应答。

　　材料和方法

　　病例选择和实验方法：从经光细胞分离法治疗的44例ctcl患者中，审核血循环中mtc符合以下特征的患者：①能用单克隆抗体tcr-v持续分离出，②表达相同的mhcⅰ类抗原。因目前可靠的vβ8特异性抗体和已知mhcⅰ类肽的数目有限，仅选择2例(患者ss和ar)，其mtc正好表达tcrvβ8蛋白。

　　分离淋巴细胞：经知情同意，从经治疗性光细胞分离法所取得的富有白细胞成分中获取外周血中单一核细胞，以磁性免疫亲和法纯化淋巴细胞[3]。用小鼠抗vβ8a(t cell science, cambridge, ma)和结合含铁小滴的羊抗小鼠免疫球蛋白(dynall corp, lake success, ny)挑选阳性mtc。用直接结合的抗cd8磁性小滴(dynall corp)挑选cd8＋非恶性t细胞。在培养时，小滴经磁性去除。挑选后，经流式细胞测定平均纯度，mtc为95％，cd8＋非恶性t细胞为84％。

　　cd8＋t细胞的制备：将cd8＋t细胞培养于含有il-2(500u/ml,genzyme)和il-7(5ng/ml)之rpmi1640和10％人ab血清中，每周用经γ照射的自身mtc(1500rads,cesium irradiator)刺激1次。再经以往所述的51cr释放的测定[3]，确定其细胞毒性。

　　提呈抗原细胞株的建立：用直接结合的抗cd3磁性小滴(dynall corp)从淋巴细胞制备中去除t细胞。其余细胞(大多为b淋巴细胞)经epstein-barr病毒孵化，使其转化。将已转化的淋巴母细胞样细胞( ＞95％的cd19＋b细胞)保留于rpmi1640和5％小牛血清(gibco)中，用以作为提呈mhc抗原的靶细胞。

　　mhc类型的确定和特异肽链的制备：应用以往所述的cdna序列化[4]，确定tcr序列。患者外周血淋巴细胞由哥伦比亚大学组织相容性定型实验室(纽约)作hla定型。将患者ⅰ类分子中已知的肽结构域单元(motif)，比较tcr cdr3蛋白序列，确定可能的靶肽[5，6]。肽由rauin symphony peptide synthesizer合成，高压液态色谱仪纯化，其纯度由主体光谱测定(mass spectrometry)证实。

　　肽识别检验：利用检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的释放，确定ctc是否能与tcr肽起反应[7]。在rpmi/0.5％ bsa中，将cd8＋细胞(效应细胞)加入经γ照射的自身b淋巴母细胞样细胞(靶细胞)，效应细胞与靶细胞的比例不一[最佳比例为（1.5～2）×105cd8＋细胞和2×104经γ照射的淋巴母细胞样细胞]。在23℃下将cd8＋细胞与来源于tcr或对照肽振荡1h。18h后用商业性比色elisa法(r＆d系统，minneapolis, mn)测试上清液。阻止试验：用人类hla a、b和c分子所共有的非多态性(non-poly-morphism)决定簇反应的小鼠单克隆抗体w6/32先阻ctc接近mhcⅰ类分子的机会(以1∶10培养上清液稀释，atcc＃hb95)，在4℃下预先孵化靶细胞30min，或比较非相关特异性的对照抗体的象征性图像(isotype)作阻止试验。孵化前用肽将细胞洗去并作上述tnf-α测定。

　　结　　果

　　患者ss和ar的外周血中mtc tcrβ it肽的hla表型分别示a29/32、b7/44、cw4/7和a11/31、b52/57、cw6/?(即未确定的第二等位基因)，ⅰ类结构域单元相同，分别为savyfcass fv mryt、vβ8 d jβ2.3和savyfcass ligg syne、vβ8 d jβ2.1，it包括的肽序列均为9个氨基酸长，所不同的只是两个氨基酸，具有预计与由cw4 mhc分子提呈和结合的结构域单元。mhc cw4分子由患者ss而非ar表达和提呈。另外，cdr3(it区)含有预计与b52 mhc分子结合的序列，b52分子由患者ar而非ss表达。

　　患者ss的tcrβ链的it肽序列(s2，vyfcassfv，含有等位基因特异性序列结构域单元的肽(agssm)(hla-cw4、hla-cw7、hla-b52)，经自身cd8＋t细胞(s11)刺激，产生tnf-α，而对照肽则不受刺激，不产生tnf-α(图1)。c1也符合cw4结构域单元，由相同2n和c末端氨基酸，cw4锚残基组成，但后者内部5个氨基酸的序列(order)则不同，而cd8＋细胞不被患者ar之tcrβ链之it肽刺激，虽然r2也与cw4结合的结构域单元相同。因此，说明cd8＋细胞在免疫应答时，不仅要与mhcⅰ一致，而且须与特异性it抗原一致。

　　图1　cd8＋细胞毒t细胞（s11）在自身恶性t细胞的tcr个体基因

　　型区一致的合成肽应答时，产生tnf-α而对照组则无相应的反应

　　阻止试验结果如图2，经抗mhcⅰ类抗体w6/32预孵，减少了tnf-α对自身it肽(s2)的应答，而具有同样象征性图像但无相关特异性的腹水(asc)则不示抑制性。经或不经0.01nmol/l肽孵化的cd8＋ctc(患者ss之s21)或患者ar之r8培养示随自身it肽的起伏而达至对照肽c1或c2所见之基底水平或cd8＋细胞(s21或r8)受无肽提呈抗原细胞刺激时所见的水平。

　　图2　应用抗mhc i类抗体（w6/32）阻止实验的结果

　　讨　　论

　　从晚期ctcl患者外周血中分离出的cd8＋ctc和自身mtc为研究抗肿瘤的选择性免疫应答提供了一个特殊的机会。如tnf-α的释放所示，本研究发现ctcl患者的外周血中cd8＋ctc可选择性地识别来源于mtc的肽。可能最有意义的是，这些ctc识别来源于mtc的tcrβ链的cdr3或it肽，而这种tcr的这一部分与tcrα链的cdr3同为ctcl的克隆扩增mtc的所特有。因抗ⅰ类骨架抗体可阻止对肽的识别，故这些cd8＋ctc可识别由mhcⅰ类分子提呈的肽。

　　具有相同mhc抗原的ctc对转移性黑素瘤患者肿瘤的消退起中介作用，并已证明在人和动物的模型中在体内可导致肿瘤消退。这些ctc能够识别来源于黑素瘤特异性蛋白的肽[8]。我们的发现，首次证明肿瘤特异性ctc能够对处于相同mhcⅰ类方式肿瘤相关特异性t细胞肽的应答。现今的研究[3]也证实，ctcl患者具有这样的cd8＋t细胞，在通过对独特抗原即tcrβ链的it的识别，对mtc作特异性免疫应答中，能够起中介作用。

　　已有的实验和临床资料，支持这样的概念即针对tcr部分具有特异性应答。如对髓鞘碱性蛋白发生特异性反应的活化t细胞可引起啮齿动物中枢神经系统的一种瘫痪病——实验性自体免疫性脑脊髓炎[9]。不过，注射已受损或非活化的同样t细胞，可刺激限于mhc的cd8＋ctc细胞的应答。这种应答可以减轻以后与同样克隆的、能独立生存的活化t细胞的刺激作用[9]。采用来源于致病性克隆的tcrβ链的肽进行接种，也能获得保护作用。

　　除动物实验外，临床研究已证明某些多发性硬化病患者具有显著致病性t细胞克隆，并显示限于应用某些vβ链。采用来源于那些tcrβ链的非it部分的肽接种于患者，似可导致临床改善[10]。再者，从健康人供给的外周血中分离出的cd8＋t细胞克隆，特异性地能识别由自身cd4＋t细胞表达的tcr vβ链[11]。不过，尚未证明这些克隆对it定位具有特异性，似不识别由标准ⅰ类分子提呈的肽。因此，我们的结果可能显示一种对来源于人类tcr的it成分的应答。从理论上，通过对tcr it的识别，人类免疫系统不仅能调节mtc，而且也调节对特殊抗原应答的t细胞。

　　本文所用缩称：ctcl：皮肤t细胞淋巴瘤，mhc：主要组织相容性复合体，ctc：活化的cd8＋细胞毒t细胞，mtc：自身恶性t细胞，tcr：t细胞抗原受体，cdr：互补决定区，it：个体基因型

　　参　考　文　献

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　　(收稿：1997－08－01　　修回：1998－05－08）