系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞中Th1型细胞因子的表达

2015-09-30 17:23:02

　　系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞中th1型细胞因子的表达

　　中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷论　著

　　作者：陈志强　李子仁　范江　岳晓玉　徐文严

　　单位：陈志强　李子仁　范江　岳晓玉　徐文严（210042 南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所）

　　关键词：红斑狼疮；系统性；白细胞介素2；干扰素ⅱ型；rna；信使；逆转录-聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　探讨系统性红斑狼疮(sle)患者中th1型细胞因子表达的情况。方法　用逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)法检测了sle患者外周血单一核细胞(pbmc)中白介素2(il-2)mrna表达(41例)和γ干扰素(ifn-γ)mrna表达(31例)的水平。结果　与正常人相比，活动期sle患者中il-2表达水平降低者占78.0％，ifn-γ表达水平降低者占83.9％。活动期sle组pbmc中il-2和ifn-γ mrna表达的平均水平也降低(p均＜ 0.01)。结论　sle患者中th1型细胞因子的表达下调，可能在发病机制中起一定作用。

　　th1－type cytokines expression in the peripheral mononuclear cells of the patients with systemic lupus erythematosus

　　chen zhiqiang, li ziren, fan jiang,et al.institute of dermatology,chinese academy of medical sciences, peking union medical college,nanjing 210042

　　【abstract】　objective　to investigate the mrna expression of th1-type cytokines in sle patients.methods　applying rt－pcr technique to semiquantitatively analyse the il-2 mrna expression in pbmcs from 41 sle patients and ifn-γ mrna expression in pbmcs from 31 sle patients.results　compared with normal controls, the sle patients with decreased expression of il-2 accounted for 78.0％ of the sle patients in active stage,and those with decreased expression of ifn-γ accounted for 83.9％, the mean levels of il-2 and ifn-γ expression in sle group were significantly decreased as well (p＜ 0.01,both).conclusion　the th1-type cytokine expression of sle patients in active stage is down-regulated,which may play a role in the pathogenesis of sle.

　　【key words】 lupus erythematosus, systemic　　interleukin-2　　interferon typeⅱ　　rna, messenger　　polymerase chain reaction

　　系统性红斑狼疮(sle)是一种自身免疫病，其抗核抗体的产生呈抗原驱动及t细胞依赖性[1，2]。t细胞可通过一些细胞因子作用于b细胞及其它细胞而影响免疫应答。目前认为在器官特异性自身免疫病中以th1型细胞浸润占优势[3]，但对sle这一全身性自身免疫病中细胞因子分布型(profile)的研究很少。我们采用逆转录－聚合酶链反应(rt-pcr)方法，对活动期sle患者外周血单一核细胞(pbmc)中th1型细胞因子白介素2(il-2）和γ干扰素(ifn-γ)mrna表达的自然水平进行了半定量分析,现报道如下。

　　材料和方法

　　一、研究对象

　　从1995年9月至1996年11月在我院门诊部和住院部就诊的患者中收集41例初诊而未经治疗或停药后复发尚未再次治疗的活动期sle患者，其中女37例、男4例，年龄16～38岁，均符合美国风湿病协会(ara)1982年修订的sle诊断标准。活动性判断按bombardier方法[4]。所有患者均无其它全身性疾病，亦无感染表现。对41例完成了il-2检测,对其中31例完成了ifn-γ的检测。10例正常人对照取自本院工作人员，女8例，男2例，年龄18～38岁。

　　二、rna的提取与cdna的合成

　　静脉取血6ml，用分层液密度梯度离心法常规分离pbmc[5]。取2×106pbmc，以异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取总rna[6]。简要步骤为加500μl变性液、50μl 2mol/l乙酸钠(ph4.0)、 500μl水饱和酚、100μl氯仿/异戊醇(49/1)；涡旋后冰浴置15min，12000r/min 4℃离心15min，取上层水相重复抽提1次后加等体积异丙醇－20℃过夜。次日再次重复抽提，离心后沉淀真空干燥，供逆转录。cdna合成采用逆转录试剂盒(gibco/brl产品)，按说明书及文献[7]进行操作。

　　三、pcr

　　反应总体积为50μl，含10mmol/l tris-hcl、1.5mmol/l氯化镁、0.2mmol/l dntp、0.25μmol/l上游及下游引物、2.5u taq dna聚合酶、2μl cdna模板。反应条件为：94℃1min变性、60℃ 1min退火、72℃ 1min延伸，共35个循环。末轮循环72℃延伸7min。以β-肌动蛋白为内参照。引物序列为：β-肌动蛋白(上游)5′-caactccatcatgaagtgtaac-3′,(下游)5′-ccacacggagtacttgcgctc-3′扩增产物180bp。il-2(上游)5′-gaatggaattaataa ttacaagaatccc-3′,(下游)5′-tgtttcagatccctt tagttccag-3′扩增产物222bp。ifn-γ(上游)5′-atgaaatatacaagttatatc-3′,(下游)5′-gatgct cttcgacctcgaaacagcat-3′扩增产物520bp。

　　四、检测及统计学分析

　　取10μl扩增产物在含0.5/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下照相。胶片经激光密度扫描仪扫描，所有扩增产物的吸光度均以β-肌动蛋白为基准校正。患者组与对照组之间的统计学分析采用方差齐性检验后的t检验或校正t检验。

　　结　　果

　　与正常人对照组相比，78.0％(32/41例)的活动期sle患者il-2 mrna表达水平降低，83.9％(26/31例)的活动期sle患者ifn-γ mrna表达水平降低。活动期sle组il-2和ifn-γ mrna表达的平均水平与正常对照组相比也显著降低，且差异有统计学意义(见表1)。为了排除上述结果系实验操作影响的可能性，我们还分别进行了il-2与β-肌动蛋白、ifn-γ与β-肌动蛋白的同管扩增(多重pcr)。多重pcr的结果进一步证实：活动期sle患者pbmc中il-2 mrna和ifn-γ mrna的表达与β-肌动蛋白mrna的表达相比确有显著下降。这些结果表明sle中th1型细胞因子的表达下调。但我们未能发现患者il-2表达水平及ifn-γ表达水平与其自身抗体水平及病情程度之间的联系。这可能和初诊患者病情差别不大有关。

　　表1　sle患者外周血单一核细胞中th1型细胞因子

　　mrna表达的平均水平（±s）

　　组别例数il-2ifn-γ

　　对照组101.09±0.141.20±0.18

　　sle组41*0.74±0.220.81±0.39

　　t值-4.764.28

　　p值-＞0.01＞0.01

　　讨　　论

　　sle患者血清或其cd8＋细胞在试管内产生的因子能抑制il-2的产生，去除cd8＋细胞可促进经凝集素诱导的il-2分泌，而在正常人则否。这提示sle患者体内的某些内源性因素在诱导其il-2分泌中起作用。曾有人报道约50％的sle患者血清中有高水平的il-2。上述结果不一致的现象说明单纯以试管内试验来检测培养细胞的il-2分泌水平有失准确，尤其易因刺激剂不同而影响结果。对sle患者中ifn-γ自然水平的研究报道较少，多数作者采用对培养细胞加刺激剂的方法来观察ifn-γ的生成。rangaraju等[8，9]曾报告sle患者pbmc中ifn-γ的表达减少，而gerez等[10]报道sle患者中ifn-γ表达可增高。上述差异不仅与研究方法有关，而且也与使用不同刺激剂有关。故我们应用rt-pcr技术来分析刚分离的、未经任何刺激剂刺激的pbmc中il-2与ifn-γ mrna的变化，结果从基因表达水平证实活动期sle患者中il-2与ifn-γ下调。关于sle中th1/th2变化的研究报告不多。我们的研究结果揭示活动期sle患者中th1型细胞因子的表达下调。th1型细胞因子的下调可能与患者抗感染能力下降有关，也可能与自身抗体的产生有某种关联。我们推测：活动期sle患者中th1型细胞因子的下调尤其是ifn-γ的下调可能解除或减轻了其对th2型细胞因子的抑制，继而发生b细胞的活化及免疫球蛋白的分泌增加。至于我们的实验未能发现患者th1型细胞因子水平与其自身抗体水平及病情程度之间的联系，可能是由于本研究着重于探讨自然条件下th1型细胞因子的表达、所收集的病例均为初诊患者、其病情差别不大而难以区别。我们正在进一步研究sle患者中th2型细胞因子的表达。

　　高等院校博士学科点专项科研基金(9502084)资助课题

　　参　考　文　献

　　[1] reeves wh, satoh m, wang js, et al. antibodies to dna, dna-binding proteins and histones. rheum dis clin north am, 1994,20:1-28.

　　[2] robertson cr, gilkeson gs, ward mm, et al. patterns of heave and light chain utilization in the antibody response to single-sranded bacterial dna in normal human subjects and patients with systemic lupus erythematosus. clin immunol immunopathol, 1992,62:25.

　　[3] liblau rs, singer sm, mcdevitt ho. th1 and th2 cd4＋ t cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune disease. immunol today,1995,16:34-38.

　　[4] bombardier c, gladman dd, urowitz mb, et al. derivation of thesledai: a disease activity index for lupus patients. arthritis rheum, 1992,35:630-640.

　　[5] 杨景山主编. 医学细胞化学与细胞生物技术. 第1版. 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1990.6-17.

　　[6] chomczynski p, sacchi n. single-step method of rna isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. ann biochem,1987,162:156-159.

　　[7]金冬雁, 黎孟枫等译. 分子克隆实验指南. 第1版. 北京:科学出版社, 1992.672-679.

　　[8] rangaraju m, gray jd, horwitz da. cytokine production in newly di- agnosed, untreated sle patients: evidence for increased production of il-10. arthritis rheum, 1994,37(suppl 9):1300.

　　[9] linker-israeli m. cytokine abnormalities in human lupus. clin immunol immunopathol, 1992,63:10-12.

　　[10] gerez l, shkolnik t, hirschmann o, et al. hyperinducible expression of interferon-gamma gene and its suppression in systemic lupus erythemato-sus. clin exp immunol, 1997,109:296-303.

　　(收稿：1998－05－20　　修回：1998－08－27）