系统性红斑狼疮患者t淋巴细胞fas抗原的表达和凋亡的研究
中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷 短篇论著
作者：申咏梅 殷志伟 杨永生 谢平 冯树一
单位：申咏梅 殷志伟 谢平 冯树一(215007 苏州医学院病理生理学教研室)；杨永生(统计学教研室)
我们利用流式细胞仪定量检测了不同病期sle患者外周血t淋巴细胞fas抗原的表达情况，并用琼脂糖凝胶电泳检测dna断裂，旨在探讨sle免疫发病机理。
一、病例和方法
(一)研究对象：sle患者为我院第一附属医院皮肤科门诊和住院患者，均符合美国风湿病协会(ara)1982年修订的诊断标准。活动期和非活动期sle的判断参照郑敏等[1]的标准。其中活动期10例，均为女性，年龄20～46岁；非活动期10例，均为女性，年龄22～51岁；正常人10例，均为女性，年龄23～48岁，为苏州市中心血库健康献血员。各组年龄、性别可匹配。
(二)检测方法：
1.t淋巴细胞的制备：取肝素抗凝静脉血5ml，用ficoll-hypaque分层密度梯度离心分离出单一核细胞(pbmc)。按张工梁等[2]的方法，用尼龙棉柱分离出t淋巴细胞。用鼠抗人cd3 mcab检测t淋巴细胞浓度 ＞90％，用台盼蓝拒染法检测其活力 ＞95％。
2.t淋巴细胞fas抗原的表达：调整t淋巴细胞浓度为5×105/ml，用染色缓冲液(pbs ph7.4，含2％灭活人ab型血清，0.1％叠氮钠)洗3次，以阻止非特异性结合。加入1抗鼠抗人fas mcab(购于法国immunotech公司)工作液5μl，4℃孵育30min，pbs洗3次；再加荧光2抗绵羊抗鼠ig-fitc(购于华美生物工程公司)5μl，4℃孵育30min，pbs洗3次。每批标本均设阴性对照，即用正常大鼠血清取代第1抗体fas mcab为阴性对照。
3.流式细胞仪检测t淋巴细胞fas阳性表达百分率及平均荧光强度(mfi)：流式细胞仪为美国coulter产品。每份标本检测5×104个细胞，在荧光直方图上可计算fas阳性峰的百分率及平均荧光强度。
(三)统计学处理：fas阳性细胞百分率值经平方根的反正弦函数转换后作方差分析，平均荧光强度采用方差分析。
二、结果
t淋巴细胞fas抗原的表达(表1)：如表1所示，sle患者t淋巴细胞fas阳性表达百分率及平均荧光强度均明显高于正常人对照组(p＜ 0.01)，且活动期明显高于非活动期(p＜ 0.01)。
表1 sle患者与正常人对照组t淋巴细胞fas阳性表达百分率及其平均荧光强度比较（±s）
组别例数fas＋百分率平均荧光强度
正常人对照组1020.86±3.652.44±0.35
非活动期sle组1037.45±5.64＊4.27±0.26＊
活动期sle组1063.67±6.06＊＊6.50±0.49＊＊
注：＊与正常人对照组比较p〈0.01；＊＊与活动期sle组比较p〈0.01
三、讨论
自1989年日本yonehara等首次报道，fas能向细胞内传导凋亡信号，fas的研究已成为分子生物学和自身免疫性疾病领域研究的热点。其表达产物为由319个氨基酸残基组成，分子量为36 000的ⅰ型跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子、神经生长因子受体家族，并命名为fas抗原(cd95)。fas是调节细胞凋亡的重要自身基因，具有重要的免疫调节功能。
我们应用流式细胞仪检测了各期sle患者及正常人对照组外周血t淋巴细胞fas阳性表达率。结果表明，sle患者明显高于正常人对照组，且活动期明显高于非活动期，这与国外报道一致。myster等[3]进一步分析了sle患者t淋巴细胞fas抗原表达升高，其中近90％的fas阳性细胞同时表达cd29抗原，提示fas表达的增强反映了sle患者体内淋巴细胞处于异常活化状态。本室近几年研究资料表明，sle患者外周血淋巴细胞亦是异常活化，并与病情具有一定相关性[4]，表明sle患者体内有免疫功能异常。
参 考 文 献
[1] 郑敏, 朱铁城. sle患者b淋巴细胞增殖功能测定及其临床意义. 中华皮肤科杂志, 1990,23:90-93.
[2] 张工梁,郑素琴, 顾文娟, 等. 分离t、b淋巴细胞的简易方法. 上海免疫学杂志, 1986,6:184-185.
[3] myster e, bini p, drappa j, et al. the apoptosis-1/fas protein in human systemic lupus erythmatosus. j clin invest, 1994,93:1029-1034.
[4] 陈家福, 殷志伟, 冯树一, 等. sle患者白细胞介素6活性的研究. 中华皮肤科杂志, 1993,26:32-34.
(收稿：1998－01－26 修回：1998－07－06)
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