沙眼衣原体中药体外敏感性试验
中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷 短篇论著
作者：谭德友 佟菊贞 涂裕英 白桦 韩建德
单位：谭德友(528000 广东省佛山市第二人民医院皮肤科)；佟菊贞 涂裕英 白桦 韩建德(中山医科大学附属第一医院皮肤科)
为了探讨中药对沙眼衣原体(ct)的体外敏感性试验方法，我们利用组织细胞培养技术测定了3种中药合剂对41株ct临床分离株的体外敏感性。现将实验结果报道如下。
一、材料和方法
(一)材料：①实验菌株：所有菌株均采自我院性病中心非淋菌性尿道炎(ngu)患者泌尿生殖道，经分离、纯化而得。②细胞株：mccoy细胞：由美国标准菌库(atcc)提供，本室保存传代。3培养基的制备：参照文献[1]方法，略加改进。
(二)药物和方法：
1.药物来源：根据ngu的3种病征配制3种中药合剂，所有中药均购自于广州市中药材公司。①中药合剂ⅰ：由黄柏(宁夏)、山栀子(云南)、连翘(河南)、大黄(四川)等组成。②中药合剂ⅱ：由柴胡(宁夏)、川楝子(四川)、车前子(江西)、龙胆草(黑龙江)等组成。③中药合剂ⅲ：由干地黄(河南)、金樱子(广东)、萆解(四川)、黄柏(宁夏)等组成。
2.药物的配制与保存：水提法配制[2]。中药经品种鉴定、粉碎、浸泡、煮沸、浓缩和过滤等过程，最后用蒸馏水调节所需浓度至1∶1(即1ml煎液相当于1g中药合剂)，调节ph至7.2，置－20℃，保存期3个月。
3.沙眼衣原体的计数方法：参照wentworth[3]方法。
4.体外试验[4，5]：①菌液的稀释：将冻存的分离株用运送培养基(2sp)作不同浓度的稀释，接种，以确定能产生多于4.5×103包涵体形成单位(ifu)/孔的接种浓度。②药液工作浓度滴定：按预试验测定的最低抑菌浓度，以此为中间值滴定9个等比稀释度，用时以无菌营养液稀释。③抑菌浓度的测定：在96孔板中，培养mccoy细胞24h，使之致密单层，按确定接种量加入待检分离株，35℃、2 000g离心1h，继续37℃ 5％ co2孵育1h，弃上清液，每孔加入0.1ml无抗生素含放线菌酮之营养液，同时加入等比稀释之药液0.1ml于各孔，每个滴定度设复孔，继续37℃ 5％ co2培养48h，弃上清液，甲醇固定，碘染色判断结果。镜下复孔均未见包涵体之最低稀释度为mic；复孔平均包涵体细胞计数近于无药对照的50％为mic50。
5.杀菌浓度的测定：①最低杀菌浓度ⅰ(mbcⅰ)：按上述方法设复板，一块染色读取mic，另未染色板直接读取mic孔细胞，弃上清液，用2sp洗涤2次，收集其未生长孔细胞继续盲传1代，48h后同前染色观察结果；以未见包涵体的最低稀释度孔浓度为mbcⅰ。②最低杀菌浓度ⅱ(mbcⅱ)：按前述方法，不同的是在接种、离心、孵育24h后，加入不同稀释度的药液，测定得到的最低杀菌浓度为mbcⅱ。
6.对照分组：①药物处理组：把不同稀释度的药液0.1ml加入mccoy细胞中，培养48h，以确定药液是否存在细胞毒作用。②无药(空白)对照组：加入已确定接种量的菌液，不加药液，与试验组同时进行。③2sp对照组：用2sp液取代药液，观察2sp对沙眼衣原体生长的影响。④蒸馏水对照组：以蒸馏水代替药液，观察蒸馏水对沙眼衣原体生长的影响。
二、结果
(一)药物对41株沙眼衣原体分离株的抑菌作用：见表1。
表1 3种中药合剂对41株沙眼衣原体分离株的抑制作用结果
| 中药
合剂 |
药物浓度 | 抑菌浓度 | |||||||
| 31.25 | 15.60 | 7.80 | 3.90 | 1.95 | 0.98 | 范围 | mic50 | mic | |
| ⅰ | 2（1） | 15（10） | 15（17） | 8（9） | 1（3） | 0（1） | 0.98～31.25 | 7.06 | 9.10 |
| ⅱ | 10（4） | 25（15） | 4（14） | 1（5） | 1（3） | 0（0） | 1.95～31.25 | 9.57 | 15.89 |
| ⅲ | 10（3） | 27（18） | 3（15） | 0（3） | 1（1） | 0（1） | 0.98～31.25 | 10.24 | 16.43 |
注：表内为抑菌数，括号内为mic50抑菌数
(二)3种中药合剂在不同给药时间杀菌作用的关系：见表2。
表2 3种中药合剂不同给药时间对沙眼衣原体分离株杀菌活性的比较（mg/ml）
| 中药
合剂 |
mbcⅰ | mbcⅱ | t值 | p值 | ||||
| 菌株数 | 几何均数 | 范围 | 菌株数 | 几何均数 | 范围 | |||
| ⅰ | 30 | 10.80 | 31.25～3.91 | 20 | 21.34 | 62.5～3.91 | 4.277 | 〈0.05 |
| ⅱ | 30 | 20.15 | 31.25～7.81 | 20 | 38.47 | 125～7.81 | 3.673 | 〈0.05 |
| ⅲ | 30 | 20.15 | 31.25～7.81 | 20 | 37.16 | 125～7.81 | 4.260 | 〈0.05 |
(三)药物的细胞毒作用及溶媒对沙眼衣原体生长的影响：测定了3种中药合剂从250mg/ml到0.98mg/ml不同浓度的药液对mccoy细胞的影响，中药合剂ⅰ和中药合剂ⅲ在250mg/ml药物浓度存在细胞毒性作用，余药物浓度及中药合剂ⅱ未见明显细胞毒作用，可见在其有效抑菌或杀菌浓度范围内3种中药合剂均未见明显细胞毒作用。对16株分离株按规定的接种量进行2sp或蒸馏水处理，结果2sp处理对沙眼衣原体的生长无明显的影响，而蒸馏水在细胞培养状态对沙眼衣原体的生长有显著的抑制作用；但是，对蒸馏水处理组进行再次盲传，被抑制的沙眼衣原体有明显的生长或数量明显增多。
三、讨论
按中医辩证施治原则ngu分为下焦湿热型、肝郁气滞型和脾肾虚型3种病征，我们在八正散、沉香散和知柏地黄丸基础上加减自拟3种中药合剂在临床上治疗ngu取得良好疗效。本试验设计3个不同程序来探讨体外试验药物的敏感性：mic测定药物对沙眼衣原体的抑制作用；mbcⅰ是在感染后即刻加药测定药物对沙眼衣原体的杀菌效应；mbcⅱ则是通过延迟性给药，在感染已形成的基础上预测药物对不同形式沙眼衣原体的杀菌作用。ehret[5]研究表明接种和加药时间间隔不同会对药物的敏感性测定产生影响，我们的研究也有类似的结果，其mbcⅰ和mbcⅱ存在显著性差异。联合这些程序进行检测，也许更能反映药物对沙眼衣原体的作用效果。结果表明，无论是原体或是代谢活跃的始体均对3种中药合剂显示一定的敏感性，3种中药合剂也可能对急性感染和慢性感染都有一定的疗效。
利用细胞培养进行体外敏感性试验，首先应排除药液的细胞毒作用对敏感性测定的影响；此外，药液的加入是否会象蒸馏水一样由于改变了培养条件而对试验产生影响?蒸馏水的处理在培养状态对沙眼衣原体的生长有一定的影响，但这种作用只是暂时性的，通过恢复其培养条件这种抑制作用会立即消失；而药物杀菌效应，恢复其培养条件并不能促使病原体生长。另外在中药敏感性测定中，稀释剂亦对试验结果产生影响；在药敏试验中应以不影响沙眼衣原体生长的2sp或营养液为稀释剂；本研究方法的建立同样亦适宜于对单味中药进行抗沙眼衣原体敏感性的测定。
参 考 文 献
[1] 叶干运. 性传播疾病. 第1版. 南京: 江苏科学技术出版社, 1988.175-177.
[2] 陈奇. 中药药理学研究方法. 第1版. 北京: 人民卫生出版社, 1993.67-68.
[3] wentworth bb. use of gentamicin in the isolation of subgroup a chlamydia. antimicrob agents chemother, 1973,3:698-702.
[4] 白桦, 佟菊贞, 宁波, 等. 泌尿生殖道沙眼衣原体对19种抗生素敏感性的研究. 中华医学杂志, 1995,75:11-14.
[5] ehret jm, judson f. susceptibility testing of chlamydia trachomatis: from eggs to monoclonal antibodies. antimicrob agents chemother, 1988,32:1295-1299.
(收稿：1998－01－21 修回：1998－12－07）
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