丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响
中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷 短篇论著
作者：李明 王强 杨春欣 陈蕾 秦万章
单位：李明 王强 陈蕾 秦万章(200032 上海医科大学中山医院皮肤科)；杨春欣(中草药制剂室)
丹参治疗系统性硬皮病(ssc)有较好的疗效[1]。我们曾观察到丹参可抑制ssc患者皮肤成纤维细胞增殖，降低细胞培养基中可溶性胶原的含量[2]，但引起胶原合成减低的作用机制尚不清楚。我们以ssc患者皮肤成纤维细胞为研究对象，通过观测丹参加入细胞培养基后对该细胞ⅰ、ⅲ型前胶原及胶原酶mrna含量的影响，从胶原基因表达方面对丹参治疗ssc的药理机制进行探讨。
一、材料与方法
(一)丹参制剂：丹参注射液是上海第一制药厂产品(批号95038，每ml折合丹参生药1.5g)；丹参素购自上海医科大学天然药化教研室；原儿茶醛(3，4-二羟基苯甲醛)系上海试剂一厂产品(批号86-07-01）。制剂配制见参考文献[2]。
ⅰ、ⅲ型前胶原及胶原酶cdna探针的制备：所采用的3个质粒分别是含有人ⅰ型前胶原α1链cdna片段(670bp)的质粒phcaliu[3]，含人ⅲ型前胶原α1链cdna片段(705bp)的质粒phfs3[4]，以及含胶原酶cdna片段(1.7kb)的质粒puc19[5]。3种探针的序列、合成、定性在上述文献中有详述。所有质粒都转化在大肠杆菌中，用标准方法扩增，碱裂解法提取质粒，peg8000纯化质粒dna，ecorⅰ对3种质粒进行酶切，使之线性化。用地高辛随机寡核苷酸引物合成均一标记的cdna探针，并检测标记效果。
(三)皮肤成纤维细胞培养：在局麻下分别切取1例22岁女性肢端型ssc患者前臂外侧活动性硬化皮损边缘皮肤以及1例整形外科手术取之青年女性前臂外侧皮肤。按leroy法进行皮肤成纤维细胞原代培养并传代增殖。实验选用第3～6代细胞。培养瓶底面积175cm2，待细胞接近融合时，更换培养基，加入丹参药液， 每个浓度重复3瓶。阴性对照组加入dmem培养基，阳性对照组加入地塞米松使浓度为1μg/ml。加药后24h收获细胞。
(四)总rna的提取和斑点杂交：采用trizol制剂(life technologies)，按改良胍-酚-氯仿一步法提取细胞总rna。测定rna含量，估算其纯度。将rna点样于硝酸纤维素薄膜上，每点含量20μg。将薄膜在80℃烘箱烘干2h后封入塑料袋中，加入预杂交液(high sds buffer)，50℃预杂交1h后改换有探针的杂交液，杂交过夜。第2天取出薄膜，进行洗脱，用blocking reagent封闭后，放入含地高辛抗体稀释液中振荡孵育，再洗脱后加入显色液中静置暗处显色，当斑点出现后，适时用te终止反应。将结果在图像分析仪上进行灰度数字转换。实验数据用t检验进行分析。
二、结果
(一)丹参对ssc患者皮肤成纤维细胞ⅰ、ⅲ型前胶原和胶原酶mrna表达的影响测定结果：丹参水溶性提取物丹参注射液、丹参素及原儿茶醛作用于ssc患者皮肤成纤维细胞24h后，对该细胞ⅰ、ⅲ型前胶原mrna的表达具有显著抑制作用，对胶原酶mrna的表达则具有显著促进作用。阳性对照地塞米松(1μg/ml)则对该细胞ⅰ、ⅲ型前胶原和胶原酶mrna的表达均具有显著抑制作用。详见表1。
表1 丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞ⅰ、ⅲ型前胶原及
胶原酶mrna表达的影响（±s）
组别ⅰ型前胶原mrna（n=3）ⅲ型前胶原mrna（n=3）胶原酶mrna（n=3）
阴性对照107.30±16.18489.50±32.54304.40±24.26
地塞米松（1μg/ml）4.99±2.170.89±0.36101.60±12.17
丹参注射液
5mg/ml13.16±2.5110.22±4.21＊＊2304.14±76.35＊
2.5mg/ml22.43±0.59＊42.99±5.11＊820.10±63.25＊
丹参素
50μg/ml8.23±3.9411.22±2.79＊970.30±53.15＊
25μg/ml11.46±1.75＊＊2.15±1.15554.60±34.67＊
原儿茶醛
100μg/ml12.71±2.63＊＊8.03±3.1＊106.90±8.22
50μg/ml22.99±4.47＊369.10±26.68＊522.10±55.77＊
25μg/ml16.28±4.36＊253.60±30.25＊1026.36±94.25＊
注：表中数值为杂交斑点实际积分吸光度值；丹参制剂与阴性对照比较，p均〈0.01；丹参制剂与地塞米松比较，＊p〈0.01，＊＊p〈0.05
(二)丹参对正常人皮肤成纤维细胞ⅰ、ⅲ型前胶原和胶原酶mrna表达的影响测定结果：丹参注射液(5mg/ml)、丹参素(25μg/ml)及原儿茶醛(25μg/ml)作用于正常人皮肤成纤维细胞24h后，对该细胞ⅰ、ⅲ型前胶原mrna表达具有显著抑制作用，对胶原酶mrna表达具有显著促进作用。地塞米松的作用与对ssc成纤维细胞的相似。
三、讨论
本文结果提示丹参治疗ssc的作用机制之一与减低成纤维细胞胶原基因的转录，从而抑制了胶原的合成有关。同时，丹参制剂尚能增加该细胞胶原酶基因的转录，可能使胶原酶合成增加，从而可能促进体内沉积胶原的分解，这可能是丹参治疗ssc的另一作用机制。地塞米松对上述前胶原基因的抑制作用比丹参制剂显著增强，但其对胶原酶基因也有抑制作用则是与丹参制剂的不同之处。故临床上用丹参制剂治疗水肿期和硬化期ssc患者有效，小剂量糖皮质激素合并丹参注射液滴注治疗早期ssc患者，疗效显著。
卫生部科研基金资助课题
参 考 文 献
[1] 苏立德, 薛伟, 仇家琴. 中西医结合治疗系统性硬皮病180例临床观察. 中华皮肤科杂志, 1985，18:215-218.
[2] 李明, 王强, 杨春欣, 等. 丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响. 中华皮肤科杂志, 1998,31:22-24.
[3] makela jk, raassina m, virta a, et al. human proα1(ⅰ) collagen: cdna sequence for the c-propetide domain. nucleic acids res, 1988,16:349.
[4] sandberg m, makela jk, multimaki p, et al. construction of a human proα1(ⅲ) collagen cdna clone and localization of type ⅲ collagen expression in human fetal tissues. matris, 1989,9:82-91.
[5] brinckerhoff ce, ruby pl, austin sd, et al. molecular cloning of human synovial cell collagenase and selection of a single gene from genomic dna. j clin invest, 1987,79:542-546.
(收稿：1998－04－28 修回：1998－12－02）
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