白介素6基因给药对BXSB狼疮小鼠发病的影响

2015-09-30 17:23:30

　　白介素6基因给药对bxsb狼疮小鼠发病的影响

　　中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷论　著

　　作者：杨高云　刘红涛　李世荫　姜学义　宋泉声　马大龙

　　单位：杨高云　李世荫　姜学义(100083 北京医科大学第三医院皮肤科)；马大龙　刘红涛　宋泉声(北京医科大学分子免疫实验室)

　　关键词：红斑狼疮；系统性；白细胞介素6；bxsb小鼠

　　【摘要】　目的　为了进一步观察白介素6(il-6)在系统性红斑狼疮(sle)发病中的作用。方法　采用基因工程方法构建了真核表达载体pcdna3-il-6，并经体内和体外实验检测到被其转染的细胞高效表达il-6和il-6 mrna。先后2次(于第1、第20天)将这种质粒多点肌注于12只3.5月龄雄性bxsb狼疮小鼠，每次每只100μg，同时用等量空载体质粒(pcdna3)肌注于10只同龄雄性bxsb狼疮小鼠作对照。结果　发现il-6在该鼠体内的过表达导致其血清ana滴度、尿蛋白水平和肾小球igg、c3沉积较对照组明显增加，血清il-6水平和肾小球il-6表达高于对照组，并有2例小鼠脾脏明显增大。结论　证实了il-6在sle发病中的病理性作用，并提示阻止或抑制il-6的产生或分泌可能有助于sle的治疗。

　　acceleration of murine lupus disease activity in bxsb mice by il-6 gene delivery

　　yang gaoyun, liu hongtao, li shiyin, et al. department of dermatology, third teaching hospital, beijing medical university, beijing 100083

　　【abstract】　objective　to study the role of il-6 in the pathogenesis of sle.methods　eukaryotic expression vector pcdna3-il-6 encoding for il-6 was constructed, and intramuscularly injected into 12 of 3.5－month-old-male bxsb mice at a dose of 100μg per mouse at an interval of 20 days, and 10 male bxsb mice with same age were injected plasmid pcdna3 at the same time as control. serum ana titer and proteinuria were monitored every 10 days, serum level of il-6, igg, c3 deposition and il-6 expression on kidney were detected at the 40th day.results　il-6 encoding plasmid had harmful effect on murine sle with increased ana level, proteinuria, igg, c3 deposition and il-6 expression on kidney compared with those of the control mice, but there was no difference on serum gpt levels between the two groups.conclusion　these results support the concept that excessive production of il-6 might play an important role in the pathogenesis of sle, which suggests that blocking or inhibiting the production or secretion of il-6 might be of therapeutic value in sle.

　　【key words】 lupus erythematosus, systemic　　interleukin-6　　bxsb mice

　　白介素6(il-6)由hirano等于1986年首先分离获得，是一种生物活性非常广泛的细胞因子，对b细胞有很强的刺激作用，能诱导b细胞分化和抗体的产生。il-6被认为是与sle发病关系颇为密切的细胞因子。nagafuchi等[1]研究表明， sle患者b细胞产生il-6增加，并表达大量il-6受体，外周血单一核细胞il-6 mrna高表达[2]，血清[3]、脑脊液甚至尿中il-6水平升高[4]，且il-6水平与疾病的活动程度和c反应蛋白有关。il-6在bxsb狼疮小鼠发病中有何作用，目前尚未见报道。我们的研究目的是通过基因给药方式使狼疮小鼠体内过表达il-6来观察其对狼疮小鼠模型发病的影响，从而进一步了解il-6在sle发病中的作用。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1.质粒及其提取和纯化试剂盒：真核表达载体pcdna3购自invitrogen公司。质粒pgem4 il-6由孙英博士惠赠。质粒提取及纯化试剂盒(qiagen plasmid giga kit, germany)购自gene公司。

　　2.bxsb小鼠：引自美国jackson laboratory(bar harbor, me)。在我院动物室封闭ⅱ级饲养。该鼠从3月龄开始发病，雄性发病早且严重。 3.5月龄雄小鼠用于本实验，体重18～20g。

　　3.工具酶、细胞株及大肠杆菌：工具酶(略)。7td1细胞株来源于骨髓瘤细胞。大肠杆菌jm109购自promega公司。

　　4.免疫组化试剂盒、抗体及丙氨酸转氨酶(alt)试剂盒：免疫组化染色sp试剂盒(zymed公司)。羊抗鼠igg单抗(荧光标记，jackson公司，效价1∶10)，兔抗鼠igg单抗(jackson公司，效价1∶500)，兔抗c3c多抗(zymed公司，效价1∶300)，大鼠抗小鼠il-6单抗(inc.公司，效价1∶300)。alt试剂盒(sigma公司)。

　　二、方法

　　1.真核表达质粒pcdna3-il-6的构建及鉴定：pgem4 il-6经bamhⅰ-kpnⅰ双酶切后，回收il-6 cdna片段(约1.0kb)，与经bamhⅰ-kpnⅰ双酶切后的pcdna3相连，构建了pcdna3-il-6载体。构建好的质粒pcdna3-il-6经ecorⅰ、xbaⅰ等酶切确证了hil-6 cdna的正确插入。用qiagen plasmid giga kit进行大量提取纯化(方法参见试剂盒说明)，体外用该质粒转染lewis肺癌细胞株，经原位杂交检测与空载体pcdna3转染细胞相比，被转染细胞浆内大量表达il-6 mrna[5]。同样用该质粒转染cos-7细胞后，细胞培养上清液中检测到大量il-6蛋白，而用空载体质粒转染的cos-7细胞上清液中却未检测到il-6蛋白。体内实验中，将该质粒及pcdna3分别肌注于bxsb小鼠，3天后，经免疫组化检测到注射pcdna3-il-6小鼠肌肉细胞浆内大量表达il-6[5]。

　　2.用药：22只3.5月龄雄性bxsb小鼠随机分为两组，a组12只作为用药组，于第1天、第20天每只小鼠后腿肌肉多点注射100μg(500μl)pcdna3-il-6；b组10只作为对照组，与a组同时并以同样方式肌注等量空载体pcdna3。

　　3.检测：两组小鼠分别于注射当天及注射后第10、20、30、40天时测尿蛋白(marcart法)：同时取血测ana(间接免疫荧光法)；于第40天检测血清il-6活性(用il-6依赖细胞株7td1检测)和alt水平(方法见试剂盒说明)；第40天取肾脏，用免疫组化方法(参见试剂盒说明)检测igg、c3沉积和il-6表达情况，并对表达结果进行计算机图象灰度分析，每只小鼠切片的免疫组化结果中取4～5个肾小球进行平均灰度值比较。原位杂交方法参见文献[5]。

　　结　　果

　　1.尿蛋白和ana检测：两组小鼠在不同时期ana检测结果见表1。pcdna3-il-6用药组(a组)第20、30、40天ana滴度均较对照组(b组)明显增高。同时检测尿蛋白水平，结果见图1。a组小鼠第20、30、40天尿蛋白水平均较b组明显增高(t检验，t值分别为2.871、2.551、2.876，p均＜ 0.05)。

　　表1　两组bxsb狼疮小鼠不同时期血清ana滴度

　　组别鼠数ana滴度秩和值tp值

　　01∶101∶401∶1601∶640

　　10d

　　a12462--105〉0.05

　　b1046---

　　20d

　　a12-255-56.5〈0.01

　　b10631--

　　30d

　　a12--57-62.5〈0.01

　　b10253--

　　40d

　　a11--17356〈0.01

　　b10172--

　　图1　两组bxsb狼疮小鼠不同时期尿蛋白水平

　　2.血清il-6和alt水平：a组小鼠第40天时血清il-6水平[（55.60±21.20）u/ml]明显高于b组[(26.33±4.68）u/ml]，经t检验，t=3.562,p＜ 0.01，而两组小鼠血清alt水平无显著性差异，均在正常范围内。

　　3.肾小球igg、c3沉积和il-6蛋白表达：经免疫组化检测并对结果进行计算机图象灰度扫描分析，a组小鼠第40天时肾小球igg、c3沉积以及il-6表达均明显高于b组，见表2。

　　4.其它：a组小鼠中有2只在第40天时脾脏明显增大，是其它小鼠脾脏平均重量的两倍左右。

　　讨　　论

　　利用真核表达载体在体内表达目的基因是近年来发展起来的基因治疗或基因给药手段之一。将真核表达质粒注射于小鼠肌肉可使外源基因在肌细胞中较长时间表达[6]。近来美国学者raz等[7]首次通过这种方式在mrl/lpr小鼠体内表达tgf-β，结果发现小鼠自身抗体水平降低，肾功能改善，生存时间延长。

　　通过基因给药方式来探讨il-6对狼疮小鼠发病的影响以及通过基因给药方式探讨bxsb小鼠发病的研究目前均未见报道。本研究通过基因给药方式首次观察到体内过表达il-6导致雄性发病期bxsb小鼠尿蛋白水平、血清ana滴度和il-6水平升高，肾小球igg、c3沉积和il-6表达增加，并有2只小鼠脾脏明显增大。导致该鼠病情加重的原因可能是il-6在体内过表达后刺激b细胞产生大量自身抗体以致ana滴度升高，肾脏免疫球蛋白和c3沉积增加，肾炎加重，从而使尿蛋白增多。il-6在肾组织中的高表达很可能是该鼠肾炎加重时的一个继发性变化。血清il-6水平升高的原因可能有两个方面，一是pcdna3-il-6在体内过表达后直接产生血清il-6水平升高，二是过表达的il-6刺激淋巴细胞、单核细胞等产生大量il-6。两组小鼠第40天时血清alt水平无明显差异并均在正常范围内，说明这种给药方式以及il-6在该鼠体内的过表达均无肝脏毒性作用。本实验结果进一步证明il-6在sle发病中的病理性作用，从而提示阻止或减少il-6的产生或分泌将有助于sle治疗。fink等[8]的实验验证了这一点，他们用抗il-6抗体治疗nzb/wf1狼疮小鼠时，发现可防止抗dsdna抗体的产生，减少尿蛋白，并延长生存时间。不过该研究仅局限于蛋白用药水平，具有诸多不便和副作用，不利于未来临床应用开发。因此，通过构建和开发真核表达il-6抑制因子载体而采用基因给药方式来缓解sle发病的研究工作给我们指出了新的研究方向。

　　参　考　文　献

　　[1] nagafuchi h, suzuki n, mizushima y, et al. constitutive expression of il-6 receptor and their role in the excessive b cell function in patients with systemic lupus erythematosus. j immunol, 1993,151:6525-6534.

　　[2] richaud-patin y, alcocer-varela j, llorente l. high level of th2 cytokine gene expression in systemic lupus erythematosus. rev invest clin, 1995,47:267-272.

　　[3] robak e, sysa ja, robak t. cytokine in systemic lupus erythematosus. przegl lek, 1996,53:623-631.

　　[4] hirohata s, miyamoto t. elevated levels of interleukine-6 in cerebrospinal fluid from patients with systemic lupus erythematosus and central nervous system involvement. arthritis rheum, 1990,33:644-649.

　　[5] yang gy, liu ht, jiang m, et al. experimental study on intramuscular injection of eukaryotic expression vector pcdna3-il-6 on bxsb mice. chin med j, 1998,111:38-42.

　　[6] eyal r, akira w, stephen m, et al. systemic immunological effects of cytokine genes injected into skeletal muscle. proc natl acad sci usa, 1993,90:4523-4527.

　　[7] raz e, dudler j, lotz m, et al. modulation of disease activity in murine systemic lupus erythematosus by cytokine gene delivery. lupus, 1995,4:286-292.

　　[8] fink bk, chan b, wofsy d, et al. interleukin 6 promotes murine lupus in nzb/nzwf1 mice. j clin invest, 1994,94:585-591.

　　(收稿：1997－12－22　　修回：1998－04－17）