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中药射干提取物对皮肤癣菌抑菌作用研究

2015-09-30 17:24:14

中药射干提取物对皮肤癣菌抑菌作用研究

中华皮肤科杂志 1998年第5期第31卷论著摘要

作者：刘春平　王凤荣　南国荣　四荣联　王刚生　郭文友

单位：050051 石家庄，河北医科大学第三医院(刘春平)；第二医院(南国荣　四荣联　王刚生　郭文友)；河北医科大学病理研究室(王凤荣)

　　本实验选用中药射干进行研究，测定各部分提取物对5种常见皮肤癣菌的抑菌作用，以期为临床采用射干提取物治疗皮肤癣菌病提供科学依据。

　　一、材料和方法

　　1.菌种：红色毛癣菌(tr)、须癣毛癣菌(tm)、犬小孢子菌(mc)、石膏样小孢子菌(mg)和絮状表皮癣菌(ef)各1株，均为购于中国协和医科大学皮肤病研究所菌种保藏中心的标准株。

　　2.药物、药物提取及培养基制备：射干1000g，由本院中药房提供。根据李应勤等^{［1］的方法，取射干1000g粉碎后，以95%乙醇回流提取3次。合并提取液，加热浓缩，得稠膏200g，加水溶解，滤去不溶物。水溶液依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压回流，三部分得量分别是25g、9g和30g。取三部分提取物和前两部分混和物(1∶1) 各2g、2g、5g和2g，分别溶于3ml二甲基亚砜中，将4种溶液分别以沙堡琼脂培养基稀释至10 0ml做为初浓度，再倍比稀释5次，得6个浓度的系列药基。设实验组、对应浓度的二甲基亚砜对照组及空白对照组。冷藏备用。}

　　3.抑菌效果观察：将5种皮肤癣菌分别移种于沙堡琼脂培养基，25℃培养7～14天，以手术刀刮取菌丝体，加入无菌生理盐水，研磨，至形成菌悬液(菌丝长度约为10～50μm)。离心(40 00r/min，5分钟)，弃上清液。取沉淀菌丝分别加入沙堡液体培养基中，用血细胞计数板调节菌丝浓度为0.5～1.0×10⁷cfu/ml。5种菌悬液分别振荡混匀，接种于实验组和对照组培养基斜面的底部，接种量10μl，平行样品3管。试管直立放置，25℃培养2周。3管均无生长为阴性，阴性管的最低药物浓度为对该菌的最小抑菌浓度(mic)。同时记录阳性管中菌丝体高度(cm)，以观察有无量效反应关系。

　　4.流式细胞术样品制备及检测：取抑菌效果最好的射干提取物，根据mic以沙堡液体培养基为基质，配制成药液，挑取tr菌落(沙堡琼脂培养基，25℃培养12天)边缘菌丝体，浸泡于药液。24小时取出，5%甲醛溶液固定，剪碎，加入0.5%盐酸胃蛋白酶1ml，37℃消化15分钟，边消化边吹打，消化后于高倍镜下可见大量单体细胞。200目尼龙网过滤，低速离心去碎片，采用溴化乙啶一步插入性染色法进行染色，500目铜网过滤，待测^［2］[ ht5”〗。同时设二甲基亚砜对照组和空白对照组，每组平行样品3份。以facs 420型流式细胞仪检测，测量数据和图形输入hp-300 consort 30计算机进行处理。测定前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器的cv值在5.0%以内。

　　5.统计学处理：用poms软件对阳性管中菌丝体高度进行直线相关回归处理。以t检验处理流式细胞术检测数据，并计算pi值^［3］。

　　二、结果

　　1.射干提取物中乙醚部分对5种皮肤癣菌的mic为1.25～2.5mg/ml。乙酸乙酯部分对tr和ef 的mic为20mg/ml，对其余3种菌在检测范围内无效。正丁醇部分在检测范围内对5种菌均无效。混和物的mic为1.25～2.5mg/ml，对tr、tm和mg的抑菌作用略强于乙醚部分，对mc和ef 的抑菌作用等同于单纯乙醚部分。

　　2.乙醚部分抗5种皮肤癣菌各管生长情况及统计学处理见附表。由附表中可以看出，乙醚部分对5种皮肤癣菌的抑菌作用均有量效反应关系。

　　　　附表　不同浓度射干乙醚提取物抗5种皮肤癣菌各管生长情况

　　(菌丝体高度)及统计学处理(cm)

皮肤癣菌	0.625mg/ml	1.25mg/ ml	r	y=a+bx	p
1	2	3	1	2	3
红色毛癣菌	0 .5^*	0.4	0.3	0	0	0	-0.9608	y=0.8-0. 64x	＜0.01
须癣毛癣菌	10	8	6	0.6	0.5	0.4	-0.7662	y=8.25-3.7143x	＜0.05
石膏样小孢子菌	6.5	6	5.5	1.1	1.0	0.9	-0.845	y =6.5-2.8571x	＜0.01
犬小孢子菌	2.5	2	1.5	0	0	0	-0.9608	y=4-3.2x	＜0.01
絮状表皮癣菌	0.3	0.2	0.1	0	0	0	-0.866	y=0.4-0.32x	＜0.01

　　注：提取物浓度为2.5、5.0、10.0、20.0mg/ml时5种皮肤癣菌各管均阴性。输入数据取至出现阴性结果的第1大组(如tr输入6组数据)

　　3.取乙醚部分mic的最高值2.5mg/ml配制药液。流式细胞计数检测结果显示，药物作用后tr s期dna含量增高，与两对照组相比均有显著性差异(p＜0.05)。两对照组之间无显著性差异(p＞0.05)。三组的pi值分别为：实验组53.95%，二甲基亚砜对照组38.33%，空白对照组38.11%，各组之间均无显著性差异(p＞0.05)。

　　三、讨论

　　中药射干属于鸢尾科植物射干的干燥根茎^［4］。关于射干抑制皮肤癣菌的研究已有报道，但均用射干全药。本实验依射干药用成分极性的增强，将其分别提取于乙醚、乙酸乙酯和正丁醇中。实验结果显示，射干的乙醚部分提取物对5种常见皮肤癣菌的抑菌效果最好，具有量效反应关系。表明射干中极性小的亲脂性成分是其抗皮肤癣菌的有效成分。

　　流式细胞计数已应用于真菌领域有关研究。皮肤癣菌通常状态下以菌丝形式存在，本实验用0 .5%盐酸胃蛋白酶对其进行消化，从而将多细胞形式的菌丝变成细胞单体。经药物作用后， tr的dna含量增高，有较强的增殖活性，可能是tr遇到不利条件时，为了生存出现的代偿性变化，或可能菌丝细胞不全有核，制成单体后，各期带核的细胞数不一致等因素所致，有待进一步研究。

　　参考文献

　　1 李应勤, 陆蕴茹, 魏璐雪. 白射干黄酮类成分的研究. 药学学报 , 1986,21∶836-841.

　　2 左连富. 流式细胞术与生物医学. 第1版. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 1996.68 -73.

　　3 李荫英, 朱永德, 郑力芬, 等. 应用fcm和tem分析人胚肺二倍体细胞. 中华物理医学杂志, 1992,14∶240-243.

　　4 江苏新医学院. 中药大辞典. 第1版. 上海: 上海科学技术出版社, 1991.1883-1 885.