真菌特异性通用引物的聚合酶链反应系统的实验与临床研究

2015-09-30 17:24:17

　　中华皮肤科杂志 1998年第5期第31卷论著

　　作者：张宏　吴绍熙　郭宁如　徐贤秀　沈永年　royl.hopfer

　　单位：210042南京，中国医学科学院　中国协和医科大学皮肤病研究所［张宏(现在广州暨南大学医学院第一附属医院皮肤科)　吴绍熙　郭宁如　沈永年］；南京大学医药与生物技术国家重点实验室(徐贤秀)；roy l.hopfer(unc hospi tals, university of north carolina, usa)

　　关键词：病原性真菌；聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　为了判断临床和实验室标本中是否存在病原性真菌。方法　设计了一个以热启动聚合酶链反应(pcr)为基础的实验方法，以一段真菌特异性dna序列作为通用引物进行检测。引物序列为：①aacttaaaggaattgacggaag；②gcatcacagacctgttattgcctc。结果　该法能在3小时之内对所用的全部23种共42株重要病原性真菌及经培养证实有真菌的22份临床标本成功地扩增出一条310bp的dna片段，但对其它微生物和人体细胞均未扩增出类似片段。该法敏感性高，特异性强。结论　采用通用性强的引物系统配合特异性高的热启动pcr技术检测临床和实验室标本中是否存在病原性真菌的方法有重要的应用潜力。

　　experimental and clinical study on detection of medically import ant fungi by pcr with a universal fungus-specific primer system　　zhan g hong, wu shaoxi, guo ningru, et al. institute of dermatology, chinese academy of medical sciences, peking union medical college, nanjing 210042

　　【abstract】　objective　to detect pathologic fungi existed in experimental or clinical specimens.methods　a hot-initiated pol ymerase chain reaction (pcr)-based method with a set of universal fungus-speci f ic primers that are capable of detecting a wide range of medically important fun g i is developed in this paper. such primers allow specific amplification of fung al dna but not other eukaryotes or prokaryotes. the gene sequences are:①aacttaa aggaattgacggaag;②gcatcacagacctgttattgcctc.results　a 310bp pro duct was successfully amplified from all 42 strains of 23 fungal species studied , and from 22 culture-proved clinical specimens within 3 hours, but not from an y strains of other microbes and human cells. this detection system is of high se nsitivity.conclusion　this highly universal primer system in combinaition with highly specific hot-initiated pcr might be used in the detection of medically important fungi in experimental or clinic al specimens.

　　【key words】　fungus　polymerase chain reaction

　　近年来，真菌对人类感染和致病的机会日益增加。根据美国药品监测网(national drug surveillance network)的资料，1988年在住院患者中真菌感染分离阳性率达1.3%［1］。在中国，过去20年中深部真菌感染率增加40倍［2］。住院患者出现条件致病性真菌感染后病死率高达29%，而无真菌感染者病死率仅17%［1］。因此对其早期诊断、及时治疗甚为重要。在生物进化过程中，真菌存在着不同于其它病原体和动物细胞的、变化极小的界特异性保守基因序列(如18srrna的编码基因)［3，4］，可用特异性手段检测之。依此理论，我们选用一段真菌界保守序列作为特异性通用引物，以聚合酶链反应(pcr)为检测手段，对含有常见病原真菌的实验室和临床标本进行研究，以判断该方法的特异性、敏感性和临床应用前景。

　　资料和方法

　　(一)菌种：所用菌种均为标准菌株：红色毛癣菌id5a、id5b株，须癣毛癣菌id8a、id8b株，玫瑰色毛癣菌id6株，石膏小孢子菌id3a、id3b、id3c株，犬小孢子菌id2c、id2d株，絮状表皮癣菌id14a、id14b株，申克孢子丝菌id22a、id22b、id22c株，烟曲霉id52b株，黄曲霉id113株，杂色曲霉id108a株，岛青霉as34025株，马内菲青霉id43株，裴氏着色真菌id60d、id60e株，紧密着色真菌id29c、id29d、id29e株，皮炎万氏霉id47c株，疣状瓶霉id30c、id30g株，甄氏外瓶霉id13b株，白念珠菌id16a、id16c、id16f、id16u、accc2002株，热带念珠菌id17c株，乳酒念珠菌id64b株，高里念珠菌id21a株，新生隐球菌id25j、id25m、id25u、id25w株，罗伦隐球菌id95v株等真菌菌株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心，金黄色葡萄球菌cmcc26063株，大肠杆菌as1505株，普通变形杆菌cmcc49101株，粪链球菌cmcc32221株，痢疾志贺氏菌cmcc51313株，淋病奈瑟球菌cmcc29106株，沙门氏菌属cmcc50336株，脆弱类杆菌cmcc81301株，青春双歧杆菌cmcc80202株，梭杆菌cmcc86102株，钩端螺旋体cmcc57603株，肺炎支原体cmcc97007株，解脲支原体cmcc99002株，星形奴卡氏菌id356株等微生物来源于上海第二医科大学。

　　(二)试剂：原生质体形成缓冲液、原生质体裂解缓冲液按文献［5］配制，novozym234系丹麦novo biolabs产品，taqdna聚合酶、pcr反应缓冲液、dntps系美国promega产品，gene releaser为美国bioventure产品。

　　(三)反应模板制备：真菌基因组dna的小量快速制备方法参照文献［5］，其它微生物和人体细胞(白细胞8份、表皮细胞4份)dna的制备按文献［4］进行。

　　(四)临床标本处理：取临床标本(血液、组织、痰、甲屑等)10μl至pcr反应管中，加入gene releaser10μl、液体石蜡油30μl，沸水浴10分钟后用作反应模板。

　　(五)pcr反应及其质量控制：

　　1.引物：本研究使用的一对引物为真菌18srdna上的一段保守序列。经查阅genebank确认与其它已知序列的物种无同源性。其碱基序列为：①aacttaaa

　　ggaattgacggaag；②gcatcacagacctgttattgcct

　　c。可扩增出310bp的dna片段。

　　2.反应体系：总体积50μl。其中含dntps200μmol/l、mgcl22mmol/l、引物各0.2μmol/l、10×pcr缓冲液5μl、taqdna聚合酶2u、模板dna1μl或临床标本10μl。

　　3.反应条件及扩增产物检测：采用热启动方式。将除taqdna聚合酶以外的其它成分充分混匀，覆30μl液体石蜡油，在dna热循环仪(perkin elmer)上加热至80℃时加入taqdna聚合酶，按以下条件扩增：94℃充分变性3分钟后，以94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟循环30次，72℃充分延伸5分钟。取10μl水相扩增产物作琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，中波紫外线观察、照相。

　　4.质量控制：每次实验均设置阴性和阳性对照，每份标本重复2次，结果相同者判为有效，否则再重做一次。并严格按kwok等［6］的防污措施进行操作。

　　结　果

　　(一)热启动pcr用于检测真菌dna的特异性：以本法对23种共42株医学上重要的真菌均如期扩增出一条310bp左右dna片段(图1)，但对细菌、支原体、螺旋体、放线菌、人体细胞等均未能扩增。无模板的反应体系亦未能扩增出阳性结果。

　　泳道1～7分别为红色毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、白念珠菌、裴氏着色真菌、烟曲霉的扩增结果及pbr322/mspⅰmarker

　　图1　热启动pcr检测几种真菌的结果

　　(二)热启动pcr用于检测酵母型真菌的敏感性：以溴化乙锭染色时，用系列10倍稀释法对新生隐球菌基因组dna进行稀释、热启动pcr扩增，可检测出5pg的dna。这相当于5～10个酵母菌中提取的dna量。

　　以血细胞计数器计数，将白念珠菌定量接种于小鼠血中，以gene releaser处理后作为pcr模板时，可检测出10～100个菌体。不含白念珠菌的小鼠血同样处理后未扩增出类似产物。

　　(三)热启动pcr从临床标本中检测真菌特异性dna的结果：22份经镜检与培养证实有真菌感染的临床标本(含红色毛癣菌者6份、须癣毛癣菌1份、犬小孢子菌1份、糠秕孢子菌3份、申克孢子丝菌2份、曲霉属1份、卡氏枝孢霉1份、念珠菌属6份、新生隐球菌1份)以热启动pcr检测时均有阳性扩增结果，扩增出一条310bp左右的dna片段；5份镜检与培养阴性的标本中有2份亦见阳性扩增结果，另3份扩增阴性。以pcr为金标准时，镜检与培养的假阴性率为7.41%。二者的符合率为92.59%。

　　讨　论

　　由于18srrna编码基因具有保守性，对已知序列的真菌可用dna序列分析、特异性探针杂交、限制性酶分析等技术进行鉴定［4］。但这些方法甚为繁杂，不适于临床实验室常规使用。而且新发现的致病真菌种类增加较快，研制种特异性诊断方法的速度难以跟上新菌种的发现速度。用真菌特异性通用引物pcr技术则可弥补以上之不足。采用热启动pcr技术、选用本文的反应体系，能对23种重要病原真菌扩增出特定dna片段。而其它所试的原核和真核细胞(包括人体细胞)均无阳性扩增结果。说明本法对扩增真菌dna有良好的特异性。

　　采用真菌特异性通用引物系统对真菌dna进行扩增以协助菌种鉴定和临床诊断的尝试已有几位学者研究过［4，7，8］。但其中有些引物的特异性欠佳［8］、有些通用性不够［7］，均使其实用价值降低。我们采用通用性强的一对引物，以热启动pcr技术弥补了普通pcr技术之不足，使特异性和敏感性均有所增加。

　　pcr技术用于感染性疾病的诊断价值有颇多异议，但一致认为它适用于生长缓慢、难以培养或目前尚不能培养的病原体的诊断［9］。真菌感染时(尤其是深部真菌)有时病情凶险、会危及生命，而常规培养至少要1周以上，往往会延误治疗。特别是对于曾不规则使用抗真菌药物的患者，真菌培养阴性但感染并未消除。以本文的热启动pcr技术可在3小时之内得知临床标本中是否存在真菌感染。结合取材部位，若从正常的无菌部位查得真菌dna，综合临床表现则可提示有真菌感染存在。

　　本研究以gene releaser处理临床标本，促使细胞内dna释放，方法简便，成本低廉，效果良好，适合临床实验室常规使用。配合本文应用的一对编码18srrna基因片段的引物及热启动pcr技术对27份临床标本检验的结果已初步显示其实用潜力。这27份标本中，22份镜检、培养与pcr检测均为阳性，3份均阴性；2份镜检与培养阴性者pcr检测阳性，这2例患者均系甲真菌病正在口服抗真菌剂治疗者。

　　我们使用的引物为真菌18srdna上的一段保守序列，经查阅genebank确认与其它已知序列的物种无同源性，从理论上说明其特异性较强。实验中使用的23种真菌包括了绝大多数致病真菌，因此有较好的代表性。尚有待进一步以更多种类的真菌及其它病原体dna作模板，同时扩大临床标本样本量以确认本方法的临床实用前景。此外，由于真菌特异性通用引物pcr反应仅能判断标本中是否有真菌存在，而不能鉴定菌种、或以此作为判愈标准，因此它的应用有局限性，不能代替真菌培养。

　　参考文献

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