药物和化学试剂体外对新生隐球菌的细胞表面疏水性和粘附性的影响

2015-09-30 17:24:25

　　中华皮肤科杂志 1998年第5期第31卷论著

　　作者：侯幼红　郭宁如　吴绍熙

　　单位：210042 南京，中国医学科学院　中国协和医科大学皮肤病研究所［侯幼红(现在广州市皮肤病防治所 510095)　郭宁如　吴绍熙(指导)］

　　关键词：新生隐球菌；细胞表面疏水性；粘附性；荚膜

　　【摘要】　目的　为探讨新生隐球菌(新隐)的细胞表面疏水性(csh)与其宿主细胞粘附性的致病关系。方法　于体外用药物和化学试剂预先作用新隐来观察医源因素(药物等)对该菌的csh、宿主细胞粘附性及荚膜的影响。在低浓度和短时间内先行药物和化学试剂(药剂)预处理该菌，再做其csh、粘附率及超微形态的测试。结果　抗真菌剂二性霉素b和氟康唑均使该菌粘附降低，而致csh呈高低不一变化。氨苄青霉素对csh和粘附性均无明显影响，但可产生类似二性霉素b所致的胞壁外层特征形态变化和无荚膜改变，而这些变化是可逆的。氟康唑致无胞壁特征性变化和无荚膜改变。植物血凝素、刀豆蛋白a、岩藻糖、巯基乙醇及胰酶均致csh和粘附降低，凝血素增加粘附率。结论　新生隐球菌的csh 、宿主粘附性及荚膜之间无致病相关性，各为独立的表面生物特性。

　　effect of drugs and chemical agents on cell surface hydropho bicity and adhesion of cryptococcus neoformans　　hou youhong, g uo ningru, wu shaoxi. institute of dermatology, chinese academy of medical sc iences peking union medical college, nanjing 210042

　　【abstract】　objective　to explore the pathogenic rela tionship between cell surface hydrophobicity (csh) and adhesion of crypt ococcus neoformans (c.neoformans) to host cells.method　some drugs and chemical agents were used to pre-treat the yeast to observe th e impact of iatrogenic factors on csh, adhesion to host cells and capsule of the yeasts which were treated pretreated with low concentration of drugs an d chemical agents for short duration in vitro.results　the results showed that both amphotericin b (amb) and fluconazole (fcz) decreased th e adhesion of the yeasts, and caused vasiation of csh. ampicillin (amp) had litt le influence on csh and adh esion of the yeasts to host cells, but it caused characteristic ultr astructural changes of outer wall of yeasts and acapsulated changes which we re reversible as amb did. fcz produced a different ultrazstructural change of the yeast′s wall and capsulated change. th e chemical agents, such as pha, cona, fucose, mercaptoethanol and trypsin decrease d csh an d adhesion level of the yeast while lectin increased adhesion level.co nclusion　the above data suggest that there is no significant relati onshi p among csh, adhesion to host cells and the capsule of c.neoformans which are three independent biologic features of the cell wall surface of ye asts.

　　【key words】　cryptococcus neoformans　cell surfa ce hydrophobicity　adhesion　capsule

　　新生隐球菌(新隐)是临床常见的条件致病真菌，其对脑部的感染较凶险，致死性高［1］。在医源因素(药物和试剂)作用下，该酵母菌的宿主细胞粘附性及其它表面生物特性(csh及荚膜)的变化具有重要意义，对阐明新隐的条件致病机理和制定防治方案亦有重要价值。本研究基于上述观念来观察新隐的宿主粘附性、csh和荚膜之间的关系，现报道如下。

　　材料和方法

　　1.vero细胞传代单层培养［2］：vero细胞株原培养用0.1%胰酶消化分散，用1640培养液调细胞浓度至1× 105细胞/ml，加0.1ml至96孔板各孔，5%co2湿温(37℃)孵育，至第5天融合成单层，倾出培养液，用0.06mol/l pbs (ph7.38)轻吸洗细胞表面1次，作为宿主细胞备用。

　　2.新隐孢子悬液制备及预作用：常规复活保存菌种新隐ifm5833，移至lee液基(37℃，孵育 18小时，100r/min)，弃液收集菌，用pbs调孢子浓度为4.2×107孢子/ml，分为两份分别作csh和粘附试验测试备用。用于做粘附试验的孢子悬液每10ml中加入12μl 3 h- 亮氨酸液，方法和试验同文献［3］。标记好的悬液调至原孢子浓度，为3h标悬液备用。用20种药物和化学试剂(名称见附表)各按1∶5、1∶50及1∶500生理盐水稀释后，再各加入等体积的3h标记和非标记孢子悬液，混合后的药剂浓度为1∶10、1∶100及1 ∶1000，各药剂作用2小时(37℃，100r/min)，pbs 1000倍稀释离心弃药剂(1500r/min)2次，再用pbs-氯化钙混合液调作用后的孢子浓度至原悬液浓度，分别作为cs h和粘附试验的测试备用，并设相应正常无药剂作用对照组。

　　附表　药物和化学试剂对新生隐球菌的表面疏水性和粘附性的影响

　　药物和化学试剂

　　表面疏水性(%)粘附率 (%)

　　±sp*±sp*

　　凝血素61.8±20 .5＜0.05

　　10.5±1.1

　　＜0.05

　　刀豆蛋白a32.4±26.7＞0.057.7±1.4＜0.05

　　植物血凝素18.5±1.3＜0.015.9±1.8＜0.05

　　岩藻糖12.2±11.7＜0.054.8±1.1＜0.01

　　木瓜蛋白酶20.5±14.5＜0.052.1±0.4＜0.01

　　β-巯基乙醇16.3±6.5＜0.012.8±0.3＜0.01

　　几丁质酶21.2±9.3＜0.0511.3±1.5＜0.05

　　胰　　酶35.1±12.9＞0.052.3±0.5＜0.01

　　环磷酰胺43.6±29.5＞0.014.1±0.7＜0.01

　　甲氨蝶呤6.7±5.0＜0.015.7±0.1＜0.01

　　青霉素g27.5±13.5＞0.258.8±0.3＞0.05

　　红霉素13.5±6.2＜0.017.2±0.6＜0.02

　　氨苄青霉素34.8±18.7＞0.059.1±0.8＞0.05

　　二性霉素b　5.7±1.2＜0.015.2±1.2＜0.01

　　氟康唑81.0±3.7＜0.013.6±1.5＜0.01

　　氢化可的松18.4±9.7＜0.058.4±0.5＞0.05

　　黄体酮11.1±2.2＜0.017.6±0.6＜0.05

　　地塞米松18.2±13.5＞0.057.9±0.6＜0.05

　　β-雌二醇12.0±0.8＜0.018.9±1.0＞0.05

　　甲基睾丸素22.5±0.5＜0.018.2±0.1＞0.05

　　正常对照39.0±4.8-9.1±2.0-

　　空白对照　　0---

　　*不同稀释作用组均数与正常对照均数的两样本t检验

　　3.粘附试验及其测定［2］：在制备好的96孔板单层培养vero细胞孔中，各对号加入3h标药剂预处理后的各孢子悬液0.1ml，置37℃温育(5% co2)1小时，pbs液轻吸洗各孔3次，弃未粘附孢子，各孔再加入70%过氯酸0.05ml和30%过氧化氢0.1m l消化vero细胞，方法见文献［3］。用dyq-01型多头细胞样品收集粘附孢子，再测各样品每分钟放射计数(min-1)，按下式换算：。各管行双管测试，并设无药剂作用对照。

　　4.csh测定［4］：用未标记的预作用悬液各对号加入3ml至酸处理空管中，再加入液态正十六烷(16℃)，旋转混匀1分钟(其间停5秒钟)，静置10分钟使脂水相分层，吸取管底水相液约2ml在石英测试杯中，于600nm波长处测各作用管的a值(曾称 od值)，按下式换算，空白对照用pbs液，行双管测试。二性霉素b和氟康唑预作用的孢子悬液还行恢复性生长培养，分为0小时、24小时、48小时及72小时，各期的csh测定同前述，并有培养生长情况的观察。

　　5.电镜观察：均用无3　h标记预作用管(1∶1000稀释度)、恢复性培养期(72小时 )及正常对照作标本，按常规电镜标本处理，行透射和扫描电镜检查。

　　6.统计学处理：各组管的csh(%)和粘附率计算均数(±s)，并做均数t检验。计算csh与粘附率的相关系数。

　　结　果

　　1.新隐的csh和粘附率变化：由附表可见，引起csh较高(60%及其以上)的氟康唑和凝血素各致新隐高低不一的粘附率。在使csh变化不大(30%＜csh＜60%)的药剂中，刀豆蛋白a、胰酶、环磷酰胺及地塞米松均不同程度地降低了粘附率，青霉素及氨苄青霉素对粘附无影响。在使csh降低(＜30%)的药剂中，木瓜蛋白酶、β-巯基乙醇、岩藻糖、二性霉素b、植物血凝素、红霉素、甲氨蝶呤及黄体酮均致粘附率不同程度地降低。可见，部分药剂一致性降低新隐的csh和粘附性。几丁质酶降低csh，增高粘附率，说明该酶底物不是胞壁粘附介导物成分。综上所述，药物和试剂预作用新隐后，造成csh和粘附率的变化呈不均一的反应，二者间的相关性低(r=-0.0899，p≤0.05)。

　　2.新隐的荚膜、粘附率及csh的超微形态变化及抗真菌药作用后的恢复性生长：正常无药剂作用的新隐细胞形态如图1，它能牢固粘附于vero细胞表面(图2)。使荚膜丧失的氨苄青霉素 (图3)、二性霉素b及氟康唑均有高低不一的csh和粘附率变化，仅二性霉素b使csh和粘附率均降低(见附表)。氨苄青霉素和二性霉素b可使胞壁外层光亮反应(图4)，二药均使csh呈低值，氟康唑增高csh，无上述壁外层特征性改变。雌二醇、地塞米松及甲氨蝶呤均降低csh 和粘附率，伴有类似氨苄青霉素所致的胞壁外层光亮区改变(图3、4)，并对荚膜的影响甚小或无。可见荚膜与csh和粘附性变化的关系不明显，三者的致病关系也不清楚。抗真菌药二性霉素b和氟康唑作用新隐后的恢复性生长及伴随的csh变化表现在：随着生长菌量的增多和csh恢复至正常水平，其相应形态变化也会得到恢复，并有荚膜形态再生(图5)。说明cs h、胞壁形态变化及荚膜改变都是可逆的。

　　图1　新生隐球菌胞壁正常形态

　　图2　新生隐球菌孢子粘附于vero细胞表面

　　图3　氨苄青霉素作用新生隐球菌后胞壁形态

　　图4　雌二醇作用后新生隐球菌胞壁形态

　　图5　二性霉素b作用新生隐球菌的恢复生长胞壁形态

　　讨　论

　　本次观察结果显示，药物和试剂作用可引起新隐csh和其宿主粘附性的反应呈高度不一致性，csh伴随的胞壁形态变化和荚膜改变均是可逆的，荚膜与csh和粘附性的关系不明确，后者与先前报道相似［5］。从结果分析看，两种抗真菌药物均使csh和粘附性发生不一致的改变，胞壁形态变化也各异，伴有荚膜丧失，但这些变化都是可逆的，其原因可能是暂时的环境变化促成新隐表面的各种生理和形态方面的短时改变，以适应此环境，随之也发生了可逆性的致病性改变，这对揭示该菌的感染机制有一定的现实意义。抗癌药(甲氨喋呤和环磷酰胺)作用也无明显的一致性结果，说明宿主免疫力受抑是感染存在的重要诱因。三种抗细菌抗生素作用对该菌的csh和宿主粘附性的影响甚微，但氨苄青霉素可使胞壁形态和荚膜出现类似二性霉素b所致的改变，这一现象的意义还不清楚，提示抗细菌剂主要是通过抑制其它正常菌群而诱发该菌感染的。糖皮质激素和性激素作用均引起csh降低，但对宿主粘附无影响，显示有促进感染的作用。

　　蛋白质破坏性试剂(巯基乙醇、胰酶及木瓜蛋白酶)可引起粘附率及csh下降或不变，说明蛋白质是胞壁粘附介导成分的组成之一。几丁质酶和木瓜蛋白酶引起粘附性变化高低不一，而使csh均降低，说明csh和粘附性的胞壁结构成分的物质基础是不同的。凝血素能结合甘露聚糖，但不阻止新隐粘附，说明该菌的胞壁粘附介导成分无甘露聚糖。岩藻糖和植物血凝素均可降低粘附性，证实新隐胞壁粘附介导成分仍与其它糖配体有关，有待进一步证实。

　　参考文献

　　1 bulmer gs. twenty-five years with cryptococcus neoformans. mycopathologia, 1990,109∶111-122.

　　2 kennedy mj. models for studying the role of fungal attachment in coloni zation and pathogenesis. mycopathologia, 1990,109∶123-137.

　　3 wu sx, guo nr, hou yh. effects of systemic fluconazole therapy on in vi tro adhesion of candida albicans to buccal epithelial cells. chi n med sci j, 1996,11∶45-48.

　　4 ofek i, whitnack e, beachey eh, et al. hydrophobic interactions of grou p a streptococci with hexadecans droplets. j bacteriol, 1983,154∶139-1 45.

　　5 richardson md, white li, mckay ic, et al. differential binding of acaps ulated a nd encapsulated strains of cryptococcus neoformans to human neut rophils. j med vet mycol, 1993,31∶189-199.