三种方法分离新生隐球菌RNA及其评价

2015-09-30 17:24:34

三种方法分离新生隐球菌rna及其评价

中华皮肤科杂志 1998年第5期第31卷论著摘要

作者：陈江汉　廖万清　温海　吴建华　姚志荣　顾菊林　刘晓刚

单位：200003 上海，第二军医大学长征医院皮肤科隐球菌专业实验室

　　如何获得高质量的生物rna，是分子生物学研究的基础和极为关键的一步。如northern印迹及杂交分析，寡聚(dt)纤维素选择分离mrna，cdna合成及体外翻译，rt-pc r等实验的成败，很大程度上决定于rna的纯度和完整性。我们参考哺乳动物细胞rna的抽提方法，并对其作了适当的修改，成功地获得了高质量的rna，同时对它们的优劣进行了初步的比较。

　　一、材料和方法

　　(一)菌株和试剂：菌株由我院中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室提供，编号为cc cc0112，为临床分离株，保存于沙堡固体培养基斜面上。试剂有：①液体培养基yepd：1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖。②溶液d：4mol/l异硫氰酸胍、25mmol/l柠檬酸钠(ph7.0 )、0.5% sarcosyl、0.1mol/l β-巯基乙醇组成。③盐酸胍匀浆1：8mmol/l盐酸胍、0. 1mmol/l醋酸钠(ph5.2)、5mmol/l β-巯基乙醇、0.5%十二烷基肌酸钠(sls)。④盐酸胍匀浆2：8mmol/l盐酸胍、0.1mmol/l醋酸钠(ph5.2)、1mmol/l β-巯基乙醇、20mmol/l e dta ph8.0。⑤licl/尿素液：3mol/l licl、6mmol/l尿素。⑥悬浮液：10mmol/l tris-cl ph7.0、1mmol/l edta ph8.0、0.5% sds。

　　(二)方法：

　　1.菌株的培养和裂解：保藏的菌株接种到固体沙堡培养基斜面上，活化3天后移种一整环菌株于100ml yepd培养基中，30℃振荡培养(200r/min)过夜，取1ml菌液离心收集菌体(4000r/ min 5分钟)，无菌生理盐水清洗后重新离心收集菌体(4000r/min 5分钟)。

　　2.rna的分离：方法1参见文献［1］。方法2参见文献［2］：以licl/尿素液悬浮菌体，移到组织匀浆器中，电动匀浆3分钟，匀浆液4℃静置4小时后移至eppendorf管中，离心12 00 0r /min 30分钟，弃上清液，加入原匀浆液1/2容积的预冷licl/尿素液振荡充分混匀，离心(12 00 0r/min 30分钟)，弃上清液，用1/2原匀浆液容积的悬浮液溶解沉淀物，加入等容积的酚∶ 氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，反复颠倒离心管，混匀10分钟，离心(3000r/min 5分钟)，吸取上清液，加入1/10体积的3mmol/l naac(ph5.2)和2倍体积乙醇，混匀，-20℃放置15分钟，离心沉淀rna(12 000r/min 15分钟)，弃上清液，75%乙醇清洗rna，风干后加入50μl depc处理过的双蒸水，溶解rna。方法3^［3］：以1ml溶液d悬浮菌体，转移到电动匀浆器中，冰浴中匀浆3分钟，移至4ml eppendorf管中，加入0.1ml 2mol/l浓度的醋酸钠，p h4.0，充分混匀后加入1ml的酚-氯仿，反复翻转混匀后剧烈摇荡10秒，冰浴中静置15分钟，样本在4℃条件下离心15分钟(13 000r/min)，吸取上清液，加入1ml的异丙醇，混匀后-2 0℃静置30分钟，离心沉淀rna(13 000r/min 15分钟)，2倍体积的冰冻乙醇清洗后，沉淀风干，以50μl depc处理过的无菌水溶解rna。

　　3.rna的检测：各取10μl rna溶液与2μl溴酚蓝混匀后，琼脂糖凝胶电泳检测rna，同时取4 μl rna样品，加水至1ml混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中，先用1ml水校正零点，2 60nm和280nm分别读出吸光度a值，检测rna的纯度和浓度。

　　二、结果

　　(一)匀浆新生隐球菌菌体时，每隔1分钟进行墨汁涂片检查和培养，在第3分钟时镜检和培养均未见菌体，重复试验时也未查见。

　　(二)无论是方法1还是方法2、3，电泳检测rna时，紫外光照射下可见清晰的3条带，以啤酒酵母和小白鼠肝细胞rna作为对照，显示其大小分别为25s、18s和5s，即三种方法均获得了能检测到的rna。

　　(三)每次取3个样本，以其平均数作为菌量，以分光光度计所测数值计算rna的浓度和纯度，重复5次后，比较3种方法的算术平均数。结果显示：方法1、2所获得的rna可见轻微dna污染，且其产量略低于方法3，方法3相对纯度高，但三者的量均低于用同样的方法3所获得的小鼠肝细胞rna而接近于啤酒酵母的rna含量。

　　　　附表　3种方法所抽提的新生隐球菌rna的各种参数

方法	比率(260/280nm)	dna	产量　　(μg/10⁵个)
方法1	1.73±0.08	测出	1.14±0.04
方法2	1.76±0.04	测出	1.09±0.02
方法3
新　生　　隐球菌	1.85±0.05	未测出	1.23±0.04
啤酒酵母	1.86±0.05	未测出	1.26±0.05
小　鼠　　肝细胞	1.86±0.04	未测出	1.69±0.04

　注：方法1、2检测的为新生隐球菌

　　三、讨论

　　rna特别是mrna的纯度和完整性主要取决于以下几个方面的因素：①不同生长期和生长条件下的新生隐球菌。本试验所获得的均为指数生长期新生隐球菌的总rna。一般而言，以yepd 为液体培养基，250ml烧瓶中在100ml培养基内接种1个菌环的菌量，30℃孵育过夜，每1ml液体中菌量可达10⁸个，我们的实验中，经孵育过夜后，每1ml的菌量为8.6×10⁷个。当然，为了获得足够的目的mrna的产量，还需改变相应的生长条件。②新生隐球菌rna的全部释放。我们的试验表明，电动匀浆后3分钟，均能彻底破坏新生隐球菌的结构，使得其r na获得满意的释放。③最主要者为实验过程中rna的降解和丢失，特别是rnase的作用。rnas e是一类生物活性非常稳定的酶，存在于细胞内外，因此预防其作用必须从两方面着手，一是实验必须在一个相对洁净的环境中进行。操作中戴手套和口罩，新的玻璃器皿和溶液均经 depc(二乙基焦碳酸盐)处理并经高压灭菌等，可以有效地防止外源rnase的破坏；二是防止细胞内rnase的作用^［4］，主要依靠异硫氰酸胍^{［3 ］}。4mol/l异硫氰酸胍和β-巯基乙醇可以极度抑制rnase的活性，而去污剂sa rcosyl又可以显著增强前者的作用，因此，我们将之应用于新生隐球菌rna的分离，获得了满意的效果。电泳图和分光光度计显示，三种方法新获得的rna均能满足分子生物学实验的要求，清晰的三条带分别为25s、18s和5s rrna，这占rna的绝大部分，由于trna和mrna的含量极微，且mrna的大小差异不确定，因此尚不足以检测到它们的存在，更无法呈现清晰的可辨的条带。实验中所获得的新生隐球菌rna的产量均少于小鼠肝细胞而接近于啤酒酵母，这可能与小鼠肝细胞的转录、翻译活动较为活跃有关。而方法3所获得的rna无论是纯度和产量上均不低于方法1、2，但后者易受到dna的污染，特别是方法2，可能由于licl的作用，偶而还会引起5s rna的丢失。

　　另外，3种方法尽管适用于大样本或少量组织的rna的提取，但方法1、2需要7小时多的时间方能完成操作，其中特别是方法1需要近20个步骤，大大繁杂于方法3，方法3步骤少，3小时即可完成，且不需要大型仪器设备，因而更为适用于新生隐球菌分子生物学的研究。特别是近几年来rt-pcr的发展，改变了分子生物学家的实验手段和效率，方法3已较多应用于哺乳动物的研究中，因此我们认为方法3以其高质量的rna和方法简单易行，费时较少更显其优势。

　　参考文献

　　1 卢圣栋. 现代分子生物学技术. 北京: 高等教学出版社, 1993.1 42.

　　2 williamson pr. biochemical and molecular characterization of the diphen ol oxida se of cryptococcus neoformans: identification as a laccase. j ba cteriol, 1994,176∶656-664.

　　3 chomczynski p, sacchi n. single-step method of rna isolation by acid g uanidini um thiocyanate-phenol-chloroform extraction. anal biochem, 1987,162∶156-159.

　　4 salas sd, bennett je, kwon-chung kj, et al. effect of the laccase gene , cnlac1 , on virulence of cryptococcus neoformans. j exp med, 1996,184∶ 377-386.