新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

2015-09-30 17:24:39

　　新生隐球菌随机扩增dna指纹分型研究

　　中华皮肤科杂志 1998年第5期第31卷论著

　　作者：温海　廖万清　姚志荣　陈江汉　吴建华　m.a.viviani

　　单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科真菌病研究室(温海　廖万清　姚志荣　陈江汉　吴建华)；意大利米兰大学卫生和预防医学研究所(m.a.viviani)

　　关键词：新生隐球菌；pcr；随机引物

　　【摘要】　目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的dna，观察dna指纹与血清型的关系，探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用3种不同寡核苷酸重复序列［cn1(gtg)5、cn2(gaca) 4和cn3(gata)4］为引物，对从临床和鸽粪中分离到的24株血清a型和8株四种血清型的新生隐球菌标准株的dna进行扩增，根据扩增产物的电泳带型来对比dna指纹和血清型之间的关系。结果　24株临床和鸽粪分离的血清a型株中，20株产生和标准株完全相似的dna带型，1株与标准d型dna带型相似。3株的pcr指纹与血清a、b、c 、d型均不相同。2株b型和2株c型产生几乎完全一致的dna指纹带型。结论　①大多数血清a型新生隐球菌菌株具有相似dna指纹带型。②血清b型和c型(gatti i变种)的dna带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的dna指纹带型。④pcr法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。

　　typing ofcryptococcus neoformans by random amplificatio n of dna fingerprinting　　wen hai, liao wanqing, yao zhirong, et al. cr yptococcus laboratory, department of dermatology, changzheng hospital attached t o the second military medical university, shanghai 200003

　　【abstract】　objective　to investigate the dna typing, observe relationship between dna fingerprinting patterns and serotypes of crypto coccus neoformans, and find a suitable genotyping standard for c rypt ococcus neoformans.methods　three primers, including cn 1(gtg)5, cn2(gaca)4 and cn3(gata)4, were used to distinguish v ariations among strains of c.neoformans.results　the distinguishable fingerprinting bands for serotype of c.neoformans were yielded by primer cn2. using this primer, of 24 clinical and env ironmental isolates of serotype a of c.neoformans and 8 standard strains investigated by pcr, 20 strains produced complete identical fingerprin ting patterns, the other 4 strains had different fingerprinting patterns. 2 stra ins of serotype b and c yielded indistinguishable fingerprinting patterns.conclusions　①the majority of strains of serotype a had similar and stable finge rprinting patterns. ②some strains of serotype b and c had an indistinguishable fingerprinting patterns. ③the same serotype strains from different sources may produce different dna fingerprinting patterns. ④the dna fingerprinting is a rap id, simple and feasible method for identifying cryptococcus neoformans .

　　【key words】　cryptococcus neoformans　pcr　primer

　　新生隐球菌是重要的条件致病菌之一，为调查新生隐球菌的流行情况，许多学者在该菌的形态学、血清学及分子生物学方面开展了许多工作。血清学已将该菌分为四型，即a、b、c和d型［1］，但这一分型方法不能区别新生隐球菌菌株间的差异，因此建立一种敏感而可靠的分型方法已显得十分迫切。目前几种分子生物学分型方法已建立［2～5］，其中包括新生隐球菌dna核型分析，dna限制性片段长度多态性分析(rflp)，但这两个方法均存在某些缺点，核型分析设备要求高，实验时间长，不适合大样本的检测，而rflp的分辨率不高，而且由于dna片段的类型复杂，客观评价比较困难。近年来用pcr方法随机扩增dna多态性来区分新生隐球菌菌株间的差异已显示出许多优越性［6，7］。据此，我们用随机引物扩增法检测了一批来自不同国家和地区的临床和野生分离株，获得满意结果。

　　材料和方法

　　(一)实验菌株：本研究采用32株新生隐球菌菌株，其中24株为血清a型(分离自意大利aids和非aids患者各6株；中国非aids患者6株；6株自意大利鸽粪中获得)，8株标准菌株中，由美国国立卫生研究所kwon-chung教授馈赠血清b、c和d型各1株，法国巴斯德研究所赠送血清a型2株，b、c和d型各1株。

　　(二)主要试剂：yma琼脂培养基购自美国sigma公司，血清分型试剂盒购自日本iatron labor atories inc公司，pcr反应试剂盒购自德国bochringer-mannkeim公司，dtab、ctab和novo zym234酶购自美国sigma公司，引物(gtg)5、(gaca)4和(gata)4由意大利primm sr l公司合成，pcr扩增仪为美国生产(gene amp pcr system 9600)。

　　(三)dna制备：实验菌株在沙堡琼脂培养基上32℃培养48小时，然后转种到yma琼脂培养基上 32℃过夜，次日用1ml蒸馏水收集菌体，采用经过改进的微量抽提法制备隐球菌dna，操作过程：将收集到的菌体(每毫升含107～8个菌体)，用scs缓冲液洗涤1次，加1毫升原生质体形成液(1毫升scs缓冲液内含20mg novozyme234酶)悬浮菌体，放37℃水浴30分钟，取 10μl原生质体液加2% sds 10μl放载玻片上，混匀后用相差显微镜检查原生质体形成率，如原生质体超过70%则进行下一步实验。4000r/min离心5分钟收集原生质体，去上清液后加6 00μl溶解液(8% dtab，1.5mol/l氯化钠，100μmol/l tris ph8.6，50μmol/l ed

　　ta)6 8 ℃温浴20分钟，加900μl氯仿充分混匀，12000r/min离心10分钟，移300μl上清液(内含d na )到新的试管，加700μl蒸馏水和100μl ctab液轻轻摇匀，10000r/min离心2分钟，倒掉上清液后加150μl 1.2mol/l氯化钠，轻轻摇匀，加500μl纯乙醇，10000r/min离心10分钟，再用70%乙醇洗涤1次，在真空离心机内干燥离心，待dna完全干燥后加30μl纯蒸馏水稀释，放-20℃冰箱备用。

　　(四)pcr扩增：采用3个简单的寡核苷酸重复序列cn1(gtg)5、cn2（gaca） 4和cn3(gata)4为引物。对制备好的隐球菌dna在pcr扩增仪上扩增。总反应体积为50 μl，其中包括：5μl 10×pcr反应缓冲液，3μl氯化镁溶液(3mol/l)，4μl dntp(400μmo l/l)，10μl引物(100pmol/l)，0.5μl taq dna聚合酶(2.5u/l)，2μl dna模板，25.5 μl灭菌双蒸水。pcr反应条件：变性94℃ 30秒；退火46℃ 30秒；延伸72℃ 60秒；共40个循环，最后在72℃延长6分钟。扩增产物在1.4%的琼脂糖凝胶内电泳，在紫外灯下照像记录电泳结果。

　　结　果

　　1.3种引物的筛选结果：实验采用3种引物在完全相同的实验条件下扩增3 株相同血清型的新生隐球菌dna，结果显示cn2(gata)4产生的电泳带型比cn1和cn 3清晰而且分辨率高(图1)。

　　1泳道为标准dna分子量；2、3、4泳道为引物cn1 ；5、6、 7泳道为引物cn2；8、9、10泳道为引物cn3

　　图1　3种引物对3株血清a型新生隐球菌dna的pcr扩增结果

　　2.4种血清型的pcr扩增结果：4种血清型不管是dna电泳带的位置还是密度均有明显的不同，但是新生隐球菌gattii变种(血清b和c型)的主要dna带型几乎不易区别(图2)。

　　1泳道为dna标准分子量；2、3泳道为a型；4、5泳道为b型；6、7泳道为c型；8、9泳道为d型

　　图2　新生隐球菌4种血清型的pcr扩增结果

　　3.血清a型株间的扩增结果：不同来源的血清a型菌株产生完全相同的pcr扩增带型，这些菌株包括来自意大利的aids患者，中国的非aids患者和意大利的野生分离株(图3)。

　　1泳道为dna标准分子量；2泳道为标准株；3 、4、5泳道为意大利的aids患者；6、7、8泳道为中国的非aids患者；9、10、11泳道为意大利的鸽粪中分离株

　　图3　不同地区和不同来源的a型株pcr扩增结果

　　4.意大利的非aids患者的血清a型菌株pcr扩增结果：6株菌株产生了几种基因带型，其中2株与a型相似，1株与d型相似，其余3株无法分型(图4)。

　　1泳道为dna标准分子量；2～7 泳道为意大利非aids患者分离株

　　图4　6株意大利非aids患者a型株的pcr扩增结果

　　讨　论

　　新生隐球菌的分型对该菌的流行病学调查以及新生隐球菌病的防治研究都具有重要意义。目前已有几种分子生物学的方法被建立，其中包括染色体电泳核型分型，线粒体dna酶切片段长度多态性及多种酶的分型，但是以上方法都存在分辨率不高，操作复杂等缺点。据此，我们用随机引物扩增法检测了一批来自不同国家和地区的临床和野生分离株，获得满意结果。

　　meyer［8］等将8种重复序列的寡核苷酸为随机引物用于新生隐球菌的分型，他认为其中3种［cn1(gtg)5、cn2(gaca)4和cn3 （gata）4］能用于新生隐球菌dna的扩增。为了筛选出最适合于新生隐球菌pcr扩增的引物，本研究选择meyer所用的3个重复序列的寡核苷酸为引物，在完全相同的实验条件下扩增3株相同血清型的新生隐球菌dna，结果显示cn2(gata)4产生的电泳带型比cn1和cn3清晰而且分辨率高。

　　本实验用cn2分别对不同血清型及相同血清型的不同菌株进行了扩增并发现了一些非常有意义的结果：①4种不同血清型的菌株产生几种各不相同的dna指纹带型，其中24株来自不同地区的临床和野生分离的血清a型株中有20株dna带型的位置和密度几乎完全相同(4株来自意大利非aids患者的血清a型株的dna带型各不相同)，并且在不同的时间多次重复实验其带型不变，这一结果提示多数新生隐球菌血清a型株不但在免疫学方面有着相同的荚膜抗原，而且有相同而稳定的基因型。②2株血清b型和c型株产生一个相似的基因带型，这也提示血清b型和c型(新生隐球菌gattii变种)之间有着较近的亲缘关系，这一结果与meyer的结果相似，但是本实验所用菌株太少，因此不能下此结论，我们准备收集更多的b型和c型株来证实这一问题。③2株标准d型株的dna带型也非常相似，但是d型株间是否有差别还需要更多的菌株来证明。④我们在检测6株来自意大利非aids患者的血清a型株中，发现仅2株与标准血清a 型株的dna带型相似，1株与血清d型株相似，另外3株的带型各不相同，后经其它方法再次鉴定证实其中一株不是新生隐球菌而是白念珠菌，其它2株虽然血清型为a型，但基因型则完全不同，究其原因尚待收集更多的类似菌来确定。虽然在全球范围内致病隐球菌以a型株最常见，但血清a型的不同株的生物学特征是有差异的，因而区分同一血清型的不同株具有重要的临床意义。实验结果已初步证明pcr方法不但能区别不同的血清型，而且在相同血清型不同株间也显示出不同，这对临床上确定疾病的复发和再感染及流行病学调查都具有重要意义。

　　本课题由意大利米兰大学卫生和预防医学研究所专项资助

　　参考文献

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