聚合酶链反应检测kaposi肉瘤组织中类疱疹病毒dna
中华皮肤科杂志 1998年第4期第31卷 论著摘要
作者：夏建新 占部和敬 堀嘉昭
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科(夏建新)；日本九州大学医学部皮肤科教室(占部和敬 堀嘉昭)
近年来，国外许多研究结果认为kaposi肉瘤与巨细胞病毒、疱疹病毒-6型、乙肝病毒、支原体等感染有关［1］。chang等［2］发现kaposi肉瘤患者皮损有类疱疹病毒(hhv-8)，并测定出其碱基排列顺序。为此，我们用一针对hhv-8基因的引物进行扩增，以研究hhv-8感染与kaposi肉瘤发病的关系。
一、材料和方法
(一)标本来源：日本九州大学医学部皮肤科及病理科近10年明确诊断为kaposi肉瘤1例(抗hiv抗体阳性)，临床可疑kaposi肉瘤2例(1例抗hiv抗体阳性，另1例阴性)，血管肉瘤、化脓性肉芽肿各1例。
(二)实验方法：
1.模板dna的制备：将标本切成10μm厚度，移至1.5ml的微离心管中，用二甲苯脱蜡、无水乙醇脱二甲苯后真空干燥20分钟，取含200μg/ml蛋白酶k的50mmol/l te缓冲液100μl加入标本中，37℃过夜，混匀后95℃加热10分钟灭活蛋白酶k，然后15?$000r/min 10分钟，pcr反应时取上清液10μl。
2.寡聚核苷酸引物［2］：引物1：5′agccgaaaggattccaccat3′，引物2：5′tccgtgttgtctacgtccag3′，这对引物扩增的片段为233bp。
3.pcr扩增：采用50μl反应体系，其中包括0.5μl taq dna聚合酶(5u/l)，4μl dntps(每种dntp 0.2mmol/l)，0.5μl的引物1及引物2(0.4nmol/l)，10μl模板dna，10×pcr反应缓冲液5μl(含mgcl２、kcl、tris-cl、triton x-100)，无菌双蒸水29.5μl，混匀后其表面覆盖一滴石蜡油，在pcr自动循环仪上按下列条件进行循环：①94℃ 5分钟，58℃ 5分钟，72℃ 2分钟；②94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分30秒，共38个循环；③94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 10分钟。反应结束后，在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳25分钟，紫外灯下观察结果。
4.产物特异性鉴定：取纯化的pcr扩增产物2份各10μl，分别加入apaⅰ及aluⅰ各1.5μl，10×酶解反应缓冲液2μl，灭菌双蒸水6.5μl，37℃温浴2小时，然后94℃加热5分钟终止反应，取消化液在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳30分钟，紫外灯下观察结果。
二、结果
5例标本中，明确诊断kaposi肉瘤者为阳性(此患者抗hiv阳性)，临床可疑kaposi肉瘤2例中抗hiv阴性者为阳性，抗hiv阳性者为阴性，化脓性肉芽肿及血管肉瘤均阴性。阳性扩增产物可被限制性内切酶apaⅰ及aluⅰ切为142bp、91bp及133bp、100bp的2个小片段，证实扩增产物为预期片段(图1)。
三、讨论
我们利用pcr技术，对可疑kaposi肉瘤患者的病理标本进行hhv-8的检测，结果临床及病理明确诊断kaposi肉瘤的1例患者2处皮损均为阳性，此患者抗hiv阳性，为艾滋病相关型。临床可疑kaposi肉瘤2例中，有1例hhv-8阳性，此患者抗hiv阴性，病理虽无kaposi肉瘤的典型改变，但也有内皮细胞及血管的增生，考虑为经典型kaposi肉瘤；另1例hhv-8阴性者，抗hiv阳性，临床虽可疑kaposi肉瘤，但病理仅见真皮浅层有少许淋巴细胞浸润，无kaposi肉瘤改变。由此可见，不论经典型或艾滋病相关型，均可检测到hhv-8。由于kaposi肉瘤的病理改变与血管肉瘤、肉芽肿性疾病不易区分，我们将血管肉瘤、化脓性肉芽肿的病理组织也进行了hhv-8的检测，结果均阴性，证实了hhv-8仅与kaposi肉瘤有关。
图1 消化液在琼脂糖凝胶中电泳结果
参 考 文 献
1 bovenzi p, mirandola p, secchiero p, et al. human herpesvirus 6(variant a) in kaposi′s sarcoma. lancet, 1993,1∶1288-1289.
2 chang y, cesarman e, pessin ms, et al. identification of herpesvirus-like dnasequences in aids-associated kaposi′s sarcoma. science, 1994,266∶1865-1869.
(收稿：1997-08-01 修回：1997-12-16)
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