差别聚合酶链反应定量检测艾滋病患者外周血前病毒DNA水平

2015-09-30 17:26:14

差别聚合酶链反应定量检测艾滋病患者外周血前病毒dna水平

中华皮肤科杂志 1998年第3期第31卷论著

作者：范雪莉　徐文严　范江　李子仁　闫小君　陈若延

关键词：聚合酶链反应；差别；艾滋病；前病毒

　　【摘要】目的　为了评价艾滋病的治疗效果、筛选有效治疗药物，了解患者体内病情变化，常常需要对治疗前后患者体内病毒水平进行客观的定量。　方法　采用差别聚合酶链反应，共同扩增待测靶基因hiv-1 gag和参照模板β-globin基因，建立起检测hiv-1复制水平的定量方法，并对8例艾滋病患者外周血前病毒dna含量进行定量。结果　8例患者的前病毒dna水平介于0.508～2.210拷贝数/μg dna之间，其复制和整合水平存在差异。　结论　该方法具有快速、可靠、重复性好等优点，非常适合于典型的临床标本的检测，为艾滋病疗效判定提供客观依据。

　　differential polymerase chain reaction for quantitation of hiv dna in periphera l blood mononuclear cell of aids patients　　fan xueli,xu wenyan,fan jia ng,et al .institute of dermatology,chinese academy of medical sciences,peking union medic al college,nanjing 210042

　　【abstract】　objective　in order to evaluate the therapeutic ef fect, to screen effective drugs for aids, and to find out the changes of patient 's condition, it is necessary to develop an objective method to quantitate the l evels of viral load of the patients before and after treatment.method　differential pcr(d-pcr) was used to co-amplify the target hiv-1 gag gen e and reference template β-globin gene, so as to determine the level of hiv repl i cation quantitatively. the levels of hiv dna in the peripheral blood mononuclear cells of 8 patients with aids were determined quantitatively.results　 the levels of the provirus of the 8 patients ranged from 0.508-2.210 cop ies/μg dna, there were differences in the levels of replication and integration . conclusion it is the authors′ opinion that this method is ea s y to control with an advantage of reliability, quickness and reproducibility, it is suitable to measure clinical specimens, and provides an objective evidence for the evaluation of responses to therapeutic intervention.

　　【key words】　pcr,differential　　aids　　provirus

　　在探索控制艾滋病的药物及各种防治途径的过程中，为了解病情变化，评价治疗效果，常常需要对治疗前后患者体内病毒水平或核酸复制状态进行客观地定量。常用的方法包括southern、northern印迹和点印迹杂交，但这些方法由于敏感性低而不能检出基因剂量的微小差别^［1］。聚合酶链反应(pcr)克服了上述缺点，可以分析极微量的dna，并可同时扩增多种序列，并发展成为一种理想的核酸定量方法。我们在普通pcr的基础上，在同一反应体系中共同扩增hiv-1靶基因和参照模板，建立起差别pcr(d ifferential pcr, d-pcr)方法用以检测艾滋病患者外周血单一核细胞(pbmc)中前病毒dna 水平。

　　材料和方法

　　(一)标本：患者外周血标本共8份采集于北京等

　　作者单位：210042 南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所［范雪莉(现在第四军医大学西京医院皮肤科)、徐文严、范江、李子仁、陈若延］；全军基因诊断技术应用研究所(闫小君)

　　地，其中7例为艾滋病患者， 1例为hiv-1感染者，均经初筛试验和确证试验证实其抗hiv-1抗体阳性。所有标本均在p3 实验室处理提取dna后运输。

　　(二)pbmc中dna的提取：

　　1.pbmc的分离：抽取艾滋病患者(或hiv-1感染者)外周静脉血5ml并用肝素抗凝，等体积生理盐水稀释后，将10ml淋巴细胞分层液缓慢加入血液层下方，2500r/min离心20分钟后吸取中间层白细胞并用生理盐水洗涤2次，离心后调整细胞浓度为10⁶/ml。

　　2.pbmc dna的提取：取1×10⁶个细胞于1.5ml eppendorf管，用u-sds裂解缓冲液(含尿素、十二烷基磺酸钠等)和pbs裂解细胞，再经酚、氯仿、异戊醇抽提蛋白、乙醇沉淀核酸后真空干燥，将沉淀溶于100μl te缓冲液中，紫外分光光度计中测定dna含量，表示为μg/ μl，dna样品的浓度=a260×核酸稀释倍数×50/1000。

　　(三)引物的设计：靶基因的扩增选择hiv-1的高度保守区域gag基因，引物的序列为jf1：tg agagaaccaaggggaagtgacat和jf2：tagtcttacaatctgggttcgcat，扩增片段的长度为314bp。参照基因选用单拷贝顺序的人类β-珠蛋白(β-globin)基因，引物的序列为po1：caact tc atccacgttca

　　cc和po2：gaagagccaaggacaggtac，扩增片段的长度为268bp ^［2］。

　　(四)差别pcr反应：在0.5ml高压灭菌的eppendorf管内加入10×pcr缓冲液、25mmol/l mgcl ₂、2.5mmol/l dntps各2.5μl，引物jf1、jf2和po1、po2的终浓度为0.4μmol/l，再加入模板5μl，然后用三蒸水将总体积补至25μl；表面覆盖30μl石蜡油，97℃预变性5 分钟后，加入taq dna聚合酶1u，混匀、离心，进行热循环，程序为：72℃，45秒；94℃，3 0秒；55℃，45秒，共40个周期，最后在72℃延伸5分钟。

　　pcr产物部分经1.7%琼脂糖凝胶电泳证实存在阳性条带后，其余部分取10μl用于8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行两种条带的分离，70v电压条件下恒压电泳4～6小时。最后将凝胶置于eb 染色液(0.5μg/μl)或银染色液中进行染色，方法见有关文献^［3］；再于紫外或可见光源下观察结果并照相，负片用于密度扫描。

　　(五)靶基因拷贝数的计算^［4］：参照文献按公式计算扩增管中靶基因拷贝数=靶基因扩增产物量/β-globin基因扩增产物量。扩增产物量指每一条带经lkb xl-222-020可见光激光密度扫描仪(瑞典)于室温下扫描时直接读出的各峰面积的积分相对值，可直接代入公式计算。最后结果即每一标本中的精确拷贝数为：管中靶基因拷贝数(拷贝数/μl)÷样品dna浓度(μg/μl)；单位为：拷贝数/μg dna。

　　结　果

　　我们首先用β-globin基因和hiv-1 gag基因的引物分别对艾滋病患者的dn a标本进行扩增，得到较为清晰的、泳动速度有差别的两种特异性条带，分别为268bp和314b p，表明两对引物扩增患者标本的pcr反应体系均正常，反应条件良好。然后将质粒pbh10 dn a(含hiv-1全基因)按一定比例稀释至经u-sds裂解缓冲液提取的正常人pbmc dna中，加入两对引物在同一反应管中共同扩增，电泳后得到两条能够区分的条带，但由于两者分子量接近，因此在琼脂糖凝胶电泳中分离时间较长。

　　对8例艾滋病患者标本用d-pcr方法进行hiv-1 gag和β-globin基因的共同扩增后，经8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳后可观察到两条区分非常清晰的条带；负片密度扫描后得到一具有两个互不融合及交叉的波峰的清晰图象。扫描所得到的各自波峰的面积即为每一条带的强度值，按前述方法计算得出的每一标本的拷贝数介于0.508～2.210/μg dna(见附表)，表明每一患者的hiv-1 dna整合水平不同。

附表　8例艾滋病患者外周血单一核细胞中前病毒dna水平

病例号	dna浓度(μg /μl)	密度强度比	拷贝数/μg dna
1	0.600	0.720	1.199
2	0.650	0.125	1.923
3	0.552	0.447	0.898
4	0.445	0.901	2.024
5	0.440	0.889	2.210
6	0.570	0.306	0.530
7	0.485	0.279	0.508
8	0.550	0.513	0.932

　　讨　论

　　常规pcr存在其固有缺点，即只能给出阳性或阴性结果、鉴别目的dna存在与否，不能反映基因量的变化，因此有许多作者采用同一管内扩增内参照模板，以校正pcr反应中管与管之间的差异^［5］。

　　我们采用差别pcr方法对hiv-1感染者pbmc中前病毒dna进行定量，选用单拷贝顺序的细胞基因β-globin基因与靶基因在同一管中共同扩增。对8例艾滋病患者pbmc dna标本分别进行 β-globin和hiv-1 gag基因扩增，均得到阳性扩增条带，证明dna标本稳定；进一步将两种引物在同一反应管中双重扩增，得到两条区分清晰的条带，表明反应体系良好，而且由于用两对引物同时扩增位于不同位置的同一条模板，这样任何影响pcr反应的因素应同时影响到两种模板的扩增。

　　国外曾有许多作者采用类似的方法来进行基因水平的定量，如lee等^［6］[ ht5 曾选择hla-dqα基因作为内参照模板也取得较为理想的结果。该方法的最大优点是简便易行，并且一次可将多份标本同时检测，非常适合于大样本的药物筛选。我们采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳使两种条带清楚地区分，然后用密度扫描仪对负片直接进行扫描读数，得出良好结果。尽管每份标本间拷贝数差别较大，但它并不反映该方法的误差，因为实际上不同的患者之间病毒整合及复制水平是完全不同的，对同一(批)患者治疗前后对比观察是定量研究的意义所在。

　　当然，本方法也存在其局限性，如只能求出相对量等。为克服这种差别pcr的缺陷，我们认为有必要在此基础上研制出更为客观的竞争性定量pcr方法来对患者体内病毒水平进行定量研究，这一点将对艾滋病治疗特别是我国中草药的筛选有着极大的推动作用。　　志谢　本研究得到北京协和医院传染科王爱霞教授、北京第二传染病院徐莲芝主任的大力帮助

参考文献

　　1 lewis de, minshall m, wray np, et al. confocal microscop ic detection of hiv-1 rna producing cells. j infect dis, 1990,162∶1373-137 8.

　　2 bauer hm, ting y, greer ce, et al. genital human papillomavirus infecti on in fe male university students as determined by a pcr-based method. jama, 1991,265∶4 72-477.

　　3 widjojoatmodjo mn, fluit ac, tobler lh, et al. rapid identification of bacteria by pcr-single-strand conformation polymorphism. j clin microbiol, 1994,32∶30 02-3007.

　　4 薛开先, 王亚平, 陈森清, 等. 差别pcr技术及检测卵巢癌c-erb-b2癌基因扩增的研究. 癌变. 畸变. 突变, 1995,7∶31-33.

　　5 fan j, bass hz, fahey j. elevated ifn-γ and decreased il-2 gene expr ession are associated with hiv infection. j immunol, 1993,151∶5031-5040.

　　6 lee th, sunzeri fj, tobler lh, et al. quantitative assessment of hiv-1 dna loa d by coamplification of hiv-1 gag and hla-dq-α genes. aids, 1991,5∶683-6 91.