非淋菌性尿道炎的生殖支原体检测

2015-09-30 17:26:23

　　非淋菌性尿道炎的生殖支原体检测

　　中华皮肤科杂志 1998年第3期第31卷论著

　　作者：王荷英　施美琴　叶顺章　张树文　王红春

　　单位：210042 中国医学科学院　中国协和医科大学皮肤病研究所

　　关键词：生殖支原体；非淋菌性尿道炎

　　【摘要】目的　为了探讨生殖支原体(myc oplasma genitalium, mg)感染与非淋菌性尿道炎(ngu)的关系。方法　对64例采自std门诊的ngu患者尿道(宫颈)分泌物标本作了mg检测。采用改良sp-4培养基作分离培养。　结果与结论　实验结果表明，9例阳性，占检测总数14.1%。其中男6例，女3例。2例合并解脲支原体感染，另1例伴有沙眼衣原体感染。9例阳性培养物经菌落形态观察、传代试验、生化反应、电镜观察及聚合酶链反应等鉴定试验证明，临床分离培养阳性株同mg标准株(g-37)的实验结果完全一致。对mg与ngu关系作了初步分析。

　　detection of mycoplasma genitalium in nongonococcal uret hritis　　wang h eying, shi meiqin, ye shungzhang, et al. institute of dermatology,chinese academ y of medica l sciences, peking union medical college, national center for std and leprosy co ntrol. nanjing, 210042

　　【abstract】　objective　to explore the relationship between mycoplas ma genitalium(mg) infection and non-gonococcal urethritis(ngu).methods the di scharge from urethra or cervical canal was tested in 64 patients with ngu at our std clinic. mycoplasma genitalium was isolated using sp-4 modi fied medium.results and conclusion the results indicated that mg was found in 9 of 64 cases( 14.1%) (6 men and 3 women). two cases were coinfected with ureaplasma u realyticum, and one with c. trachomatis. the mg isolates were confirmed by colony morpholo gy, s ubcuture test,biochemical reactions,electronmicroscopic observation and polymera se chain reaction. the isolates were consistent with mg reference strain,g-37. the correlation between mg and ngu were preliminarily discussed.

　　【key words】　mycoplasma genitalium　nongonoccocal urethritis

　　迄今国内对生殖支原体(mg)感染所致泌尿生殖系统疾患的研究开展尚少。由于mg的分离培养所需营养要求高、培养时间较长，而血清学诊断又因其与肺炎支原体有广泛的交叉反应而受到限制。鉴于上述原因，在一定程度上影响了mg的临床和基础研究的发展。我们对64例非淋菌性尿道炎(ngu)患者的尿道(宫颈)分泌物作了mg的分离培养和鉴定，现将结果报道如下。

　　资料和方法

　　一、研究对象

　　标本采自我所std门诊的64例ngu患者。其中男49例，女15例。年龄20～54岁，平均年龄32岁。临床诊断根据病史、症状、体征和实验室检查结果，符合ngu［1］。病期数天至3年不等。

　　二、标本采集及mg分离培养方法

　　取尿道(宫颈)分泌物标本洗于mg液体培养基试管中。置37℃温箱培养，每日观察液体培养基颜色有无改变。若培养基(含酚红指示剂)颜色由红变为黄色，透明无沉淀，表明可能为mg阳性。然后将经0.45μm微孔滤膜过滤后的培养物，以 1∶10比例转种到新的mg培养液中作传代观察。与此同时，取上述适量培养物接种于mg固体培养基上，放烛缸中37℃孵育，以观察是否有煎蛋状菌落。

　　三、生殖支原体标准菌株(g-37)来源及培养基制备

　　mg标准菌株由南京铁道医学院赵季文教授惠赠。mg培养基参照sp-4培养基配方作改良后制成。ph为7.6～7.8。mg液体培养基以2.5ml分装于每支螺旋盖试管中，置4℃冰箱中备用。mg固体培养基中含1%琼脂。

　　四、mg鉴定试验

　　(一)观察菌落形态：将待鉴定的mg液体培养物移种到mg固体培养基上，置37℃烛缸培养，待培养基出现由红变黄的颜色反应，表明已有支原体生长。取出固体培养基后，用dien es法染色，在低倍显微镜下检查是否有呈蓝色的煎蛋状菌落。

　　(二)传代试验：经滤器过滤后的液体培养物作反复传代，观察是否能传代，并观察mg生长特点。

　　(三)生化反应：

　　1.发酵葡萄糖试验：将培养物接种于含0.5%葡萄糖培养基(含酚红指示剂)中，观察ph 变化。mg能分解葡萄糖，使培养基ph下降，培养基颜色由红变为黄色。解脲支原体(uu)及人型支原体无此特性。

　　2.水解精氨酸及尿素试验：培养基中不加葡萄糖，分别加入0.15%精氨酸及0.15%尿素，观察ph变化情况。mg不能水解精氨酸及尿素，因此不发生ph变化。

　　(四)电镜观察：取液体培养物，经超速离心后制成超薄涂片，作负染色，镜检。观察电镜下形态并照相。

　　(五)聚合酶链反应(pcr)试验：采用套式pcr方法检测mg16sr rna基因(引物由无锡市克隆遗传技术研究所提供)，终产物为535bp dna扩增片段。操作顺序如下：将标本振荡后洗涤于1ml生理盐水中，再取洗涤液200μl 15 000r/min，离心5分钟，弃上清液。加裂解液混匀后，55℃孵育1小时。经高温灭活后再次离心，取上清液作为首次扩增模板。循环条件为93℃ 预变性2分钟、93℃30秒、55℃30秒、72℃60秒共35个循环。首次扩增产物经蒸馏水稀释后作为第2次扩增模板，循环条件如前，终产物有535bp的dna条带为阳性。每次检测均设置阴性、阳性对照。

　　中国医学科学院、中国协和医科大学科研基金资助课题

　　结　果

　　(一)64例患者分泌物作mg检测，结果表明，9例阳性(占检测总数14.1%) 。阳性培养物(或标本)作pcr试验也证明均为mg阳性，与标准mg(g-37)完全一致。在9例mg 阳性病例中，有2例合并uu感染，1例合并沙眼衣原体(ct)感染。由此可见，在泌尿生殖道有mg感染的ngu，同样可合并其他病原体感染。在9例mg阳性病例中，男6例，女3例。

　　(二)mg株的鉴定试验结果：

　　1.菌落形态观察：mg菌落在固体培养基上呈煎蛋状(见图1)。经dienes染色后呈蓝色，直径大小为16～200μm。

　　2.传代试验：经0.45μm滤膜过滤后的培养物能传代。培养基发生颜色变化即由红色变为黄色的时间为6～46天。初代生长的时间比较长，每代平均生长时间为2周左右。

　　3.生化反应：mg菌株能发酵葡萄糖，使含葡萄糖培养基ph下降，由红色变为黄色；但不能利用精氨酸及尿素，在含有精氨酸及尿素的培养基中接种mg后，37℃培养1周，未见培养基发生颜色变化。

　　4.电镜观察：在电镜下，经6万倍放大，可见到单个mg形态似“南瓜”状，顶部似有特殊的结构，有明显颈部，底部宽。见图2。此外，也有呈球形mg。

　　5.聚合酶链反应结果：用套式pcr法检测mg-16sr dna基因，其阳性菌株终产物为535bpdna 扩增片段。见图3。

　　在鉴定试验中，临床株与mg标准株的实验结果

　　图1　mg菌落呈蓝色煎蛋状

　　图2　mg电镜下负染形态(×60 000)

　　1～4：临床标本mg株，5：mg标准株(g-37)，

　　6：阴性对照，m：pcr marker

　　图3　pcr试验检测结果

　　图4　mg似南瓜状(转拍自tay lor-robinson d.

　　genitourin med,1995,7∶1-8)

　　完全一致。

　　讨　论

　　生殖支原体系1981年tully等［2］首先从2例ngu患者尿道标本中分离出来并命名。近年来，国外对mg已进行了一些研究，临床和动物试验证明，mg可引起急性和慢性ngu，尤其是非衣原体性ngu。mg可能和妇女上生殖道疾病相关。有人认为，泌尿生殖道可能是mg感染和寄居的主要部位。本研究从64例ngu患者的尿道(宫颈)分泌物中分离培养出9株mg(14.1%)，其阳性培养物经菌落形态观察、传代试验、生化反应、电镜观察和pcr试验结果表明，培养分离出的临床mg株的生物学特征与mg标准株(g-37)的鉴定试验结果一致，由此可见，经培养分离出的9株支原体可确认是mg。mg生长缓慢，甚至可超过2～3个月。生长所需要的营养成分复杂，本研究使用我所研制的改良sp-4培养基，mg出现明显生长的时间为6～46天。此结果表明，经改良的sp-4培养基对mg的分离培养是可取的。taylot-robinson［3］报告，单个mg具有“南瓜” 状形态(见图4)，本研究所观察到的电镜下形态与其接近，顶部有特殊结构，似吸盘状。

　　资料表明，mg可引起急、慢性ngu及妇女生殖道炎症。horner报告［ 5］，取急性ngu男性患者109例尿道标本及55例无ngu男性标本作mg检测，结果表明，前者阳性率为23%(24/ 103)，后者仅3例阳性(6%)。jensen等［4～6］也相继报告了mg与ngu 的发生密切相关，他们用dna探针和pcr方法检测mg，得到了证明。而且在无衣原体性ngu患者中，mg阳性率更常见。本研究结果也表明，mg阳性病例也主要发生在非衣原体性ngu患者标本中。据报告，应用pcr技术检测结果表明，std门诊中约20%的妇女在下生殖道部位查到mg，提示mg具有性传播性。moller等［7］在166例盆腔炎患者中，用代谢抑制试验检出31例患者有抗mg抗体，40%急性输卵管炎患者的血清抗体出现有意义增高。给母猴输卵管接种mg，2周后出现炎症，上皮及肌粘膜层间出现炎性细胞，可能与该支原体的粘附性与特殊结构有关。

　　本研究结果表明，mg感染可合并其他病原体。在9例mg阳性病例中，有3例标本分别检出uu及ct，这与taylor-robinson等报告［8］的淋菌性尿道炎可合并mg感染类似。因此，mg合并其他病原体感染的问题，应引起重视。

　　参考文献

　　1 中华人民共和国卫生部卫生防疫司．性病防治手册．第2版．南京：江苏科学技术出版社, 1994.48-54.

　　2 tully jg, taylor-robinson d, cole rm, et al. a newly discovered mycop lasma in the human urogenital tract. lancet, 1981.1288-1291.

　　3 taylor-robinson d. the history and role of mycoplasma genitali u m in sexually transmitted disease. genitourin med, 1995,71∶1-8.

　　4 jensen js, qrsum r, dohn b. mycoplasma genitalium∶ a c ause of male urethritis? genitourin med, 1993,69∶265-269.

　　5 horner pj, gillroy cb. thomas b j et al. association of mycopl asma genitalium with acute nongonococal urethritis. lancet , 1993,342∶5 82-585.

　　6 jensen js, hansen ht,lind k. isolation of mycoplasma genitaliu m strains from the male urethra. j clin microbiol. 1996,3∶286-291.

　　7 moller br, robinson d a, furr pm, et al. serological evidence implicat ing mycoplasma genitalium in pelvic inflammatory disease. lan cet, 1984,1∶1102-1103.

　　8 taylor-robinson d, furr pm, hanna n f. microbiological and serological study of non-gonococcal urethritis with special reference to mycoplasm a genitalium. genitourin med, 1985,61∶319-324.