黄芩甙对白三烯B4引起的银屑病患者中性粒细胞趋化反应的影响

2015-09-30 17:26:57

　　黄芩甙对白三烯b4引起的银屑病患者中性粒细胞趋化反应的影响

　　中华皮肤科杂志 1998年第2期第31卷论著摘要

　　作者：秦小卫　郑茂荣　牟贤龙　孙君红

　　单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院(秦小卫)；第二军医大学附属长海医院(郑茂荣　牟贤龙　孙君红)

　　中草药黄芩为清热燥湿药，其主要成分为黄芩甙。现代研究表明：黄芩甙有广谱抗菌、抗炎与抗变态反应作用。我们应用琼脂糖玻片法证实：黄芩甙对白三烯b４(ltb４)引起的银屑病患者中性粒细胞(pmn)趋化反应有抑制作用，从而为黄芩甙治疗银屑病提供了理论依据。

　　一、材料和方法

　　(一)病例：寻常型银屑病患者20例，男11例，女9例；年龄17～55岁，平均33岁；总病期7天至15年，平均5年。现病期(复发或新发疹时间)7天至3个月。健康对照组20例，男10例，女10例；年龄20～45岁，平均30岁。所有受试对象在实验前2周内未用任何其它药物。

　　(二)主要试剂及设备：人淋巴细胞分离液(lsm)：上海试剂二厂。dextran t500：瑞士pharmacia公司产品。琼脂糖(agarose)：日本进口，上海化学试剂采购供应站分装厂。dmem培养基：法国life technologies公司产品。ltb４标准品(5ng/ml)：美国sigma公司产品。血小板活化因子(paf)标准品(10-7mol/l)：法

　　表1　不同浓度黄芩甙对ltb４引起的pmn趋化反应(抑制率%)的影响(±s)

　　组　别例数

　　黄芩甙浓度

　　5μg/ml10μg/ml15μg/ml20μg/ml

　　银屑病组2026.8±1.42944.3±1.41264.6±1.54077.9±1.624

　　健康对照组2025.6±1.45545.0±1.42063.8±1.52478.0±1.690

　　t值-0.89990.43170.78660.7240

　　p值-＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

　　注：孵育时间为2小时

　　表2　黄芩甙对不同趋化因子引起的pmn趋化反应(抑制率%)的影响(±s)

　　趋化因子

　　黄芩甙浓度

　　5μg/ml10μg/ml15μg/ml20μg/ml

　　ltb４26.8±1.42944.3±1.41264.9±1.54577.9±1.624

　　paf2.58±0.022.56±0.052.56±0.052.57±0.03

　　t值82.79468.63778.56084.284

　　p值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

　　注：孵育时间为2小时

　　表3　不同孵育时间黄芩甙对ltb４引起的pmn趋化反应(抑制率%)的影响(±s)

　　组　别例数

　　孵育时间

　　30分钟1小时2小时18小时

　　银屑病组2015.3±1.36528.3±1.38044.3±1.40262.5±1.526

　　健康对照组2014.6±1.34726.9±1.36545.0±1.42062.6±1.580

　　t值-0.62400.82640.43170.7625

　　p值-＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

　　注：黄芩甙浓度为20μg/ml国巴黎大学benvenist教授赠送。黄芩甙粉剂：第二军医大学植化教研室廖时萱教授制备及赠送。不锈钢打孔器：自制，孔径为2.4mm。

　　(三)方法：

　　1.pmn的分离与制备：分离后制成的细胞悬液，计数为2.5×10５细胞/ml。

　　2.琼脂糖凝胶板的制备：将琼脂糖液均匀平铺于76mm×26mm的灭菌载玻片上，水平放置，用孔径为2.4mm不锈钢打孔器，打孔6列，每列为一组，每组又分为外、中、内3孔。

　　3.pmn移行的测定方法：①实验组4列的中孔中分别向每毫升白细胞悬浮液中添加5μg、10μg、15μg、20μg黄芩甙，对照组2列的中孔中为不加任何药物的白细胞悬浮液。②6列的外孔中均加ltb４或paf溶液作为趋化因子，内孔均加dmem培养液作为对照。③将加入上述药物的玻片放入37℃孵箱中分别培养0.5小时、1小时、2小时、18小时。④取出玻片，待孔中液体干燥后，先后在玻片上加纯甲醇和37%缓冲福尔马林液各3ml，30分钟以中断细胞移行，完整地去除琼脂糖胶，待玻片细胞干燥后，用wright染色在显微镜下用显微测微尺测量玻片上pmn趋化移行和随机移行的距离。⑤依下式计算趋化移行和随机移行的抑制率：

　　抑制率=(实验组距离-对照组距离)/(对照组距离)×100%

　　4.统计学方法：采用两样本均数的t检验。

　　二、结果

　　不同浓度的黄芩甙分别与pmn孵育2小时，能明显抑制ltb４对pmn的趋化反应，与黄芩甙的浓度呈剂量依赖关系(表1)。黄芩甙对daf引起的pmn趋化反应则无明显影响(表2)。

　　黄芩甙(20μg/ml)分别与pmn孵育30分钟、1小时、2小时、18小时后对ltb４引起的pmn趋化反应的抑制作用逐渐增加，24小时后抑制作用不再增加(表3)。

　　黄芩甙对银屑病组及正常人对照组pmn对ltb４的趋化反应的影响无显著性差异(表1、3)。实验也证实了银屑病患者及正常人pmn对ltb４的趋化反应无显著性差异。单纯pmn悬浮液孵育不同时间对pmn趋化反应无影响；黄芩甙对pmn的随机移行无明显抑制作用。

　　黄芩甙对银屑病患者不同病期及不同皮损面积时pmn对ltb４的趋化反应的影响无显著性差异。

　　三、讨论

　　研究发现：ltb４是一种强有力的趋化因子［1］，银屑病患者皮损内ltb４的含量明显高于正常人［2］，因此推测：银屑病患者皮损内异常增高的ltb４吸引真皮血管内的pmn聚集、趋化，致银屑病皮损表皮内形成微脓肿等典型的银屑病病理改变。kreisle等发现：ltb４是通过与pmn膜表面的ltb４受体结合而发挥作用的［3，4］。鉴于以上分析，我们推测：如果某种药物能够抑制ltb４引起的pmn趋化反应，可望治疗银屑病。

　　我们应用琼脂糖玻片法证实黄芩甙能够抑制ltb４引起的pmn趋化反应，因此推测黄芩甙是通过阻断ltb４与pmn膜特异性受体结合而发挥其拮抗作用的。本实验结果表明黄芩甙对ltb４引起的银屑病患者及正常人pmn趋化反应的抑制作用无显著性差异。有资料表明：银屑病患者pmn与正常人pmn差别在于两者活化程度不同，而不同活化程度的pmn膜ltb４受体与ltb４结合能力相差不明显［5］。因此推测银屑病患者与正常人pmn膜ltb４受体与黄芩甙结合能力相差不明显。实验表明黄芩甙对ltb４引起的银屑病患者静止期或进展期pmn趋化反应的抑制作用无显著性差异，对不同皮损面积的pmn趋化反应的抑制作用也无显著性差异。临床实践证实黄芩甙对病期不同、皮损面积不同的银屑病患者均有较好的疗效。另外，实验表明：黄芩甙对其它趋化因子如paf引起的pmn趋化反应无明显抑制作用，说明了黄芩甙对pmn趋化反应的抑制作用是特异的，即只抑制ltb４引起的pmn趋化反应，进一步说明了黄芩甙可能是作为ltb4受体拮抗剂发挥作用的。

　　参　考　文　献

　　1 bray ma. the pharmacology and pathophysiology of ltb４. br med bucl, 1988,39∶249-254.

　　2 fogh k, herlin t, kragballe k. eicosanoids in acute and chronic psoriasis lesions: leukotriene b４, but not 12-hydroxy-eicosatetraenoic acid, is present in biologically active amounts in acute guttate lesions. j invest dermatol, 1989,92∶837-841.

　　3 kreisle r, parker cw. specific binding of ltb４ to a receptor on human polymorphonuclear leukocyte. j exp med, 1983,157∶622-641.

　　4 lin a, patrilia l, et al. ltb４ binding to human neutrophils. prostaglandins, 1984,28∶837-849.

　　5 khler s, christophers e, schrder jm. plasma lactoferrin reflects neutrophil activation in psoriasis. br j dermatol, 1988,119∶289-293.

　　(收稿：1997-04-29　　修回：1997-08-01)