血小板衍生生长因子在硬皮病成纤维细胞的表达
中华皮肤科杂志 1998年第1期第31卷 论著摘要
作者：郑学毅 张建中 马圣清
单位：100034 北京医科大学第一医院皮肤科［郑学毅(现在广州市第一人民医院内科风湿病组) 马圣清］，人民医院皮肤科(张建中)
血小板衍生生长因子(platelet-de-rived growth factor, pdgf)是参与纤维化形成的主要因子［１］，近年国外研究发现在硬皮病皮损处pdgf蛋白表达增高［２］。我们采用northern杂交方法检测了培养硬皮病皮损成纤维细胞pdgf-b链mrna的表达，现报道如下。
一、材料和方法
主要试剂：pdgf-b链cdna探针，β-actin cdna探针，购自atcc(american type culture collection)，随机引物试剂盒购自美国promega公司。
研究对象：病例为北京医科大学第一医院确诊的局限性硬皮病3例、系统性硬皮病1例，诊断符合美国风湿病协会的标准。男1例，女3例，年龄21～56岁，病程0.5～8年。局限性硬皮病标本取自皮损边缘，系统性硬皮病取自前臂屈侧。正常人对照为1例
附表 硬皮病成纤维细胞pdgf-b链mrna的相对值表
mrnapdgf-b链mrna专用单位
n1n2s1s2s3s4
pdgf-b链2.8kb mrna0.11840.06470.28740.44520.37080.4215
pdgf-b链4.0kb mrna0.01390.01580.02640.03180.03420.0018
n1、n2正常对照，s1、s2、s3、s4硬皮病患者；以上是3次杂交结果的算术平均数成人皮肤和1例正常小儿包皮。
皮肤成纤维细胞培养：将无菌标本的真皮剪成1～2mm３小块，按合适密度放在干燥培养皿底，在洁净台内静置10分钟，组织块因水分蒸发即可自行与皿底结合，以dmem培养基培养，三代或四代细胞用于实验。
细胞总rna的提取和northern杂交：细胞总rna的提取按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法进行，rna经甲醛变性凝胶电泳后转移至尼龙膜，与32p标记的pdgf-b链或β-actin探针杂交，最后-70℃放射自显影。
结果分析：杂交条带经密度扫描，然后以pdgf-b链mrna吸光度值除以β-actin吸光度值得出pdgf-b链mrna专用单位。因β-actin mrna在同一种细胞的含量是一致的，其量与总rna的量成正比，pdgf-b链mrna专用单位为每一定量β-actin吸光度中pdgf-b链mrna量，意义在于消除加样不均所致的每一样本mrna量的不一致。
二、结果
培养硬皮病患者和正常人皮肤成纤维细胞有pdgf-b链2.8kb和4.0kb两种mrna转录体表达，在硬皮病成纤维细胞pdgf-b链2.8kb mrna的表达是正常对照的2～3倍，4.0kb mrna是对照组的1.5～2倍，在硬皮病组内，pdgf-b链2.8kb mrna的表达是4.0kb mrna的
pdgf-b mrna
β-actin mrna
n1、n2正常对照，s1、s2、s3、s4硬皮病患者；此为同一尼龙膜杂交结果
图1 硬皮病成纤维细胞pdgf-b链mrna的表达
16～20倍(图1，附表)。
三、讨论
硬皮病发病机制仍不清楚，leroy报道培养的硬皮病皮损成纤维细胞传15代仍具有增高的胶原合成能力，因而提出了硬皮病存在胶原合成异常这一观点［３］。为探讨pdgf在硬皮病纤维化中的可能作用，我们采用成纤维细胞培养和northern杂交方法，检测了pdgf-b链mrna在培养硬皮病和正常人皮肤成纤维细胞的表达。实验所用细胞为四代以内培养细胞，仍保持细胞原有的表型和特征，因而正常人和硬皮病患者来源的成纤维细胞可进行比较。研究发现培养硬皮病成纤维细胞pdgf-b链mrna表达较正常人皮肤成纤维细胞明显增高，与gay［２］等人报道的硬皮病皮损局部pdgf蛋白表达增高是一致的，说明pdgf-b链可能参与了硬皮病的发生。rojas-valencia［４］报道正常人肺和特发性肺纤维化肺来源的培养成纤维细胞同时表达2.8kb和4.0kb pdgf-b链两种mrna转录体，以2.8kb转录体为主。此结果与我们的结果一致，说明pdgf是一种参与纤维化的重要生长因子。局限性硬皮病和系统性硬皮病均有皮肤纤维化，本实验未发现两者的pdgf-b链mrna表达有差异。有意义的是本实验还发现硬皮病成纤维细胞pdgf-b链2.8kb mrna转录体的表达是4.0kb mrna的16～20倍。
参 考 文 献
1 ross r. peptide regulatory factors: platelet-derived growth factor. lancet, 1989,ⅰ(8648)∶1179-1182.
2 gay s, jones re, huang g, et al. immunohistologic demonstration of platelet-derived growth factor and sis-oncogene expression in scleroderma. j invest dermatol,1989,92∶301-303.
3 leroy ec. connective tissue synthesis by scleroderma skin fibroblasts in cell culture.j exp med, 1972,135∶1351-1362.
4 rojas-valencia l, montiel f, montano m, et al. expression of a 2.8kb pdgf/c-sistranscript and synthesis of pdgf-like protein by human lung fibroblasts. chest,1995,108∶240-245
(收稿：1996-09-18 修回：1997-04-17)
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