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抗凋亡基因Bcl-2在皮肤良恶性肿瘤中的表达

2015-09-30 17:28:06

　　抗凋亡基因bcl-2在皮肤良恶性肿瘤中的表达

　　临床皮肤科杂志 2000年第4期第29卷临床及实验研究

　　作者：万力　高顺强

　　单位：河北医科大学第四医院皮肤科，河北石家庄050011

　　关键词：肿瘤；皮肤；bcl0-2蛋白；鳞癌

　　摘要：为探讨bcl-2蛋白与皮肤肿瘤的关系，作者用流式细胞免疫荧光技术，检测了33例皮肤良恶性病变。结果显示：bcl-2蛋白的相对含量fi(fluorescenceindex)在恶性肿瘤中的表达明显

　　高于良性肿瘤，p＜0.001。提示细胞凋亡抑止作用在肿瘤的发生、发展中也起着重要的作用，同时研究下调bcl-2的机制，可能成为bcl-蛋白过度表达肿瘤治疗的一种途径。

　　中图分类号：r739.5文献标识码：a文章编号：100 0－4963(2000)04

　　expression of apoptosis-suppressing protein bcl-2 in the benign

　　and malignant skin tumors

　　wan li, gao shun qiang

　　(department of dermatology, the 4th hospital, hebei medical university, shijiazhuang，050011)

　　abstract:in order to explore the relation ship between bcl-2 protein and the skin tumors, authors analysed 33 cases of various skin tumors with immunofluorescence staining technique and flow cytometry. the results showed that the fluorescence

　　indices(fi) representing the relative content of bcl-2 protein in malignant skin tumors were all higher than those in benign ones, p＜ 0.001.this suggested that the bcl-2 was very likely play an important role in the develoment and progress of the

　　skin malignant tumors. we studed further the mechanism of reducing the expression protein of bcl-2, may be become a treatment method to the tumors with over expressed bcl-2 protein.

　　key words: tumors, skin; bcl-2protein, scc

　　近年来，关于肿瘤发生机制的研究表明，多数肿瘤均有癌基因的异常表达，原癌基因异常常引起细胞过度增生，但细胞凋亡受阻，在肿瘤发生中也起着重要作用[1]。bcl－2基因(b－cell lymphoma/leukemia 2 gene)的表达产物为bcl－2基因蛋白，可抑制细胞凋亡。已发现不少肿瘤有该蛋白的过度表达，如b细胞淋巴瘤、基底细胞癌等[2,3]。本研究应用流式细胞免疫荧光技术对33例皮肤良恶性病变细胞中的bcl－2蛋白相对含量进行了定量分析，以探讨该蛋白与皮肤良恶性肿瘤的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　标本来源：采用我院1989年～1997年活检及手术切除标本的石蜡包埋组织块，其中鳞状细胞癌(scc)10例，角化棘皮瘤(ka)10例，脂溢性角化病(sk)10例，另设3例正常皮肤组织为对照，共计33例。所有病例均由有经验的病理医师做出诊断。

　　1.2　细胞dna含量检测的样品制备：每例石蜡组织块切取40μm左右厚度切片3～5片分别放入试管内，依次脱蜡、水化、以搓网法制取单细胞悬液，调整细胞数为1×106/ml后，用溴化乙啶

　　对dna染色，置4℃冰箱30min后上机测定[4]。

　　1.3　bcl－2蛋白免疫荧光染色样品的制备：对1×106/ml的单细胞悬液进行间接免疫荧光标记，一抗应用1∶100倍的鼠抗人bcl－2蛋白单克隆抗体(美国santa cruz公司)，二抗应用1∶100倍的羊抗鼠fitc－igg。上机测定时，除设正常皮肤对照外，还设有pbs阴性对照，1∶100倍的fitc－igg及bcl－2单抗阳性对照。操作过程详见文献[5]。

　　1.4　流式细胞检测方法：使用facs420型(美国bd公司产品)流式细胞仪进行测定，方法详见文献[5]。

　　1.5　测量资料的分析方法：dna含量以di值(dna index，di)作为判定细胞核dna含量的标准，di=样品细胞的g0/g1峰均道值/正常皮肤组织细胞g0/g1峰均道值。di=1.0±2cv为二倍体肿瘤，di≠1.0±2cv为异倍体肿瘤。bcl－2基因蛋白表达的定量分析按照morkve等[6]提出的荧光指数(fluore scence index,fi)表示，计算公式为：fi=(肿瘤细胞bcl－2表达的平均荧光强度－对照样品的平均荧光强度)/正常皮肤组织细胞bcl－2表达的平均荧光强度。

　　1.6　统计学处理方法：采用t检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　脂溢性角化病(sk)，角化棘皮瘤(ka)，鳞状细胞癌(scc)及正常皮肤组织对照的di值、fi值及显著性检验见表1，2。

　　表1　各种瘤细胞di、bcl－2的fi值(±s)

　　组织类型例数difi

　　ⅰ sk100.993±0.0691.042±0.103

　　ⅱ ka100.973±0.0341.063±0.086

　　ⅲ scc101.251±0.1581.451±0.118

　　ⅳ 对照31.003±0.0120.957±0.000

　　表2　各组dna含量、荧光指数不同均数的显著性检验(t检验)

　　ⅰ－ⅱⅰ－ⅲⅰ－ⅳⅱ－ⅲⅱ－ⅳⅲ－ⅳ

　　dit值0.7274.1670.4838.7320.7242.417

　　p值＞0.4＜0.001＞0.5＜0.001＞0.4＜0.05

　　fit值0.4958.2541.3939.0892.0787.057

　　p值＞0.5＜0.001＞0.1＜0.001＞0.05＜0.001

　　由上面两表可以看出，良性肿瘤(sk，ka)及正常皮肤中dna含量及bcl－2蛋白相对含量均低于恶性肿瘤(scc)，p＜0.001或＜0.05；而良性肿瘤间以及良性肿瘤与正常皮肤间无统计学差别。在各

　　10例皮肤肿瘤中，sk无dna异倍体，ka有2例，而scc有9例出现。

　　3　讨论

　　肿瘤的发生被认为是一种对细胞正常自身稳定的破坏，结果导致细胞过度增殖或死亡减少。随着一些调控细胞增殖的致癌基因的发现和研究，对肿瘤细胞过度增殖的分子机理日益明晰，而对细胞死亡的调控仍知之较少。近年来，有关细胞凋亡机制与肿瘤关系的研究已成为肿瘤分子生物学研究的一项重要内容。bcl－2是目前与细胞凋亡关系密切的原癌基因之一，参与了细胞凋亡的调控，其编码蛋白能抑制细胞发生凋亡，并能在生长因子缺乏时延长细胞存活时间[1]。人的bcl－2基因通常位于18号染色体q21.3着丝点方向的端粒上，由3个外显子和两个潜在的启动子组成。它是一种跨膜蛋白，位于线粒体内膜、内质网和核膜上，含有239个氨基酸。bcl－2参与14/18染色体易位，易位后的bcl－2基因表达增强，bcl－2编码的蛋白为bcl－2蛋白，可保护细胞防止凋亡的发生。它能促进细胞增殖，导致肿瘤的发生。nakagawa等[7]用免疫组化法研究了几种表皮角质形成细胞良性及恶性增生疾病，发现基底细胞癌和鳞状细胞癌bcl－2蛋白阳性表达率分别为67％和100％，光线性角化病的bcl－2蛋白阳性表达率为25％，而且为弱阳性表达，其余良性增生均为阴性表达。本研究支持上述观点。而国外学者[8,9]认为bcl－2在scc中表达率很低甚至几乎不表达，这可能与检测方法及标本的不同处理有关。

　　本研究结果表明：鳞状细胞癌的fi值与脂溢性角化病、角化棘皮瘤及正常皮肤的fi值具有非常显著性差异(p＜0.001)，而良性增生(sk、ka及正常皮肤)间无统计学差异(p＞0.1或p＞0.5)。bcl－2蛋白在鳞状细胞癌中过度表达表明scc中存在肿瘤细胞凋亡抑制机制，这使得肿瘤细胞因寿命延长而过度积聚，使肿瘤组织不断发展、扩大。同时也说明肿瘤的发生机制，不仅有细胞过度增生所起的作用，细胞凋亡受阻同样也起者重要的作用。因此研究下调bcl－2的机制，可能成为bcl－2蛋白过度表达肿瘤治疗的一种途径。

　　参考文献：

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　　[2] triscott ja, ritter jh, swanson pe, et al. immunoreactivity for bcl-2 protein in cutaneous lymphomas and lymphoid hyperplasias[j]. j cutan pathol, 1995,22(1):2～ 10.

　　[3]涂平，李宁.凋亡抑制蛋白bcl－2在皮肤基底细胞癌中的表达[j].临床皮肤科杂志，1997，26(3)：149～151.

　　[4]陈秀鉴，左连富.基底细胞癌dna的流式细胞术分析[j].中华物理医学杂志，1988，10(2)：99～101.

　　[5]左连富，周道安，齐凤英，等.定量分析乳腺癌细胞p53基因产物死亡表达[j].中华物理医学杂志，1994，16(2)：78～80.

　　[6] morkve o, laerun od. flow cytometric measurement of p53 protein expression and dna content in paraffin embedded tissue from bronchialcarcinomas[j]. cytometry, 1991,12(1):438～ 443.

　　[7] nakagawa k, yamamura k, maeda s, et al. bcl-2 expression in epidermal keratinocytic disease[j]. cancer,1994,74(6):1720～ 1724.

　　[8] jeanette morales ducret cr, rijn mvd, lebrun dp, et al. bcl-2 expression in primary malignancies of the skin[j].arch dermatol, 1995,131(8):909～ 912.

　　[9] verhaegh me, sander cj, arends jw, et al. expression of the apoptosis-suppressing protein bcl-2 in nonmelanoma skin cancer[j]. br j dermatol, 1995,132(5):740～ 744.

　　收稿日期：1999-06-28；修回日期：2000-02-23