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降钙素基因相关肽在银屑病斑块型皮损的分泌与表达

2015-09-30 17:28:14

　　临床皮肤科杂志 2000年第4期第29卷临床及实验研究

　　作者：何焱玲　丁桂凤　候凌飞　邓玉兰　王宪　朱铁君　范少光

　　单位：朱铁君何焱玲（北京医科大学人民医院皮肤科，北京100044）；邓玉兰丁桂凤（北京医科大学免疫学系，北京100083）；王宪候凌飞（北京医科大学心血管研究所，北京100083）；范少光（北京医科大学生理学系，北京100083）

　　关键词：银屑病；神经肽；降钙素基因相关肽

　　摘要：为了解精神心理刺激诱发加重银屑病的原因，探讨神经肽在银屑病发病机理中的

　　作用。研究了降钙素基因相关肽(cgrp)在银屑病皮损中的分泌与表达，并确定cgrp作用

　　的靶细胞。应用特异性放射免疫反相法分析，测定32例寻常型银屑病慢性斑块型皮损组

　　织提取液中cgrp的含量，用抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合物法和兔抗人

　　cgrp抗体进行免疫组化染色，观察cgrp分泌表达的部位和作用的靶细胞。结果寻常型银

　　屑病慢性斑块型皮损组织提取物中cgrp的含量高于正常人，经统计学分析有显著性差异

　　(p＜0.01)。同时免疫组化染色形态学观察发现cgrp分泌表达于皮损真皮毛细血管壁周及内

　　皮细胞表面，以及表皮细胞间和树枝状细胞表面。提示寻常型银屑病斑块型皮损局部神

　　经肽cgrp的分泌增加，皮损真皮微血管内皮细胞和表皮树枝状细胞与神经肽cgrp密切接

　　触。cgrp与银屑病局部病变密切相关。

　　中图分类号：r758.63文献标识码：a文章编号：1000-4963(2000)04

　　expression and secretion of calcitonin gene related peptide in psoriatic plaque lesions

　　he yan ling,zhu tie jun

　　（department of dermatology, people's hospital, beijing medical university, beijing 100044， china）

　　ding gui feng

　　（department of immunology, beijing medical university, beijing 100083, china）

　　hou ling fei, wang xian

　　（institute of cardiovascular disease, beijing medical

　　university, beijing 100083, china）

　　deng yi lan, fan shaoguang

　　（department of physiology, beijing medical university, beijing 100083,china)

　　abstract: in order to study the mechanism of the effect of stress on psoriasis and the involvement of neuropeptides in psoriatic pathogenesis, we investigated the expression and secretion of calcitonin gene related peptide(cgrp) in psoriatic plaque

　　lesions, then identified the target cells of cgrp in psoriatic plaque lesions. specific radioimmunoassay(ria) was used to determine cgrp secretive content and immuno histochemistry staining with biodin avidin peroxidase compound method to observe the target cells of cgrp in psoriatic plaque lesion tissue of 32 cases of psoriasis vulgaris. the results showed that the content of cgrp in psoriatic plague lesions was higher than that of normal controls(p＜ 0.01).cgrp was also found on periphly and the endothelial cells of the dermal capillaries and on the surface of epidermal dendrite cells in psoriatic plaque lesions. it indicated that pathogenesis of psoriatic plaque lesions was related to the overexpression of neuropeptide cgrp, which closely contacted with the dermal microvascular endothelial cells and epidermal dendrite cells in psoriatic plaque lesion.

　　key words: psoriasis;neuropeptide; calcitonin gene related peptide

　　精神心理刺激和应激反应可诱发和加重银病，而且在紧张状态下银屑病皮损的神经肽含量增加[1]。作为皮肤重要神经递质的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptid,cgrp)与表皮和真皮的多种靶细胞接触，其功能还不清楚。但有研究提示cgrp可能直接影响皮肤角质形成细胞、郎格汉期细胞、微血管内皮细胞功能[2～5]。为了解精神心理刺激诱发加重银屑病的原因，探讨神经肽cgrp在银病发病中的作用，我们研究了cgrp在寻常型银屑病患者斑块型皮损中的分泌与表达、cgrp作用的靶细胞，获得了有意义的结果。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　病例：活检组织取材于32例寻常型银屑病患者躯干和四肢伸侧持续存在的慢性斑块型皮损，女11例，男21例；年龄平均42例(20～65岁)；病程平均17年(2～35年)。正常对照组取材于28名正常人相应部位的皮肤。

　　1.1.2　试剂与仪器：hcgrp抗体和125i－cgrp(由北京医科大学王宪教授惠赠，分别购自美国半岛公司和英国amersham公司)：放免缓冲液(0.1％bsa,0.01％nan3,5mmol/lnacl和0.1％ttritonx－100的0.1mol/lpbs)；abc免疫组化试剂盒(购自中山生物试剂公司)；低温离心机(cpkr型，美国beckman公司)；γ－计数器(1470型，瑞士wallac公司)；冷凝浓缩干燥机(git100型，美国savant公司)；dmrixa显微镜(德国leica公司)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　特异性放射免疫分析：cgrp放射免疫分析测定采用特异性放射免疫反相法[6]进行。分别取银屑病慢性斑块型皮损及正常人对照组的皮肤组织约100mg(湿重)，放于1mol/l冰醋酸2ml，100℃煮沸10min，研磨制成组织匀浆，在4℃以4000r/min离心20min，取上清液1ml/管，放入待测试管，经真空干燥后，储存于－20℃。

　　将收集的干燥待测样本以200μl放免缓冲液复溶。样本和cgrp标准品与兔抗人cgrp抗血清(100μl/管)于4℃孵育24h，再加入125i－cgrp(100μl/管)混匀后于4℃孵育24h，加入放免缓冲液分离剂(1ml/管)，在4℃放置25min，使结合的125i－cgrp与游离的分离，再于4℃以3000r/mon离心20min，弃上清液，用γ－计数仪测定沉淀中125i的放射性强度。以2.5～1000pg/管的系列cgrp标准品(以pg为单位)，分别测其放射性强度与总管比较，通过γ－计数仪绘制cgrp标准曲线，进一步计算样品中cgrp的含量(单位为pg)，放免最低监测浓度为2.5pg。

　　1.2.2　免疫组织化学染色：用常规的免疫组织化学染色方法，取寻常型银屑病躯干及四肢伸侧斑块型皮损组织及对照组正常人的皮肤组织，10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋连续切片(5μm)，常规脱蜡至80％酒精，3％h2o2甲醛封闭15min，经微波炉修复抗原后，用血清封闭在37℃孵育20min，加入1∶500兔抗人cgrp抗体，于4℃孵育过夜后，滴入1∶200生物素化羊抗兔igg抗体，在37℃孵育30min，常规tbs清洗，加1∶100abc液，于37℃孵育50min，dab－h2o2染色，苏木素复染封片。以pbs和未免疫兔血清代替一抗作阴性对照，用鼠脊神经节细胞作阳性对照。

　　1.2.3　统计学分析：cgrp放射免疫分析检测后的结果数据x±s表示，两组间比较采用t检验，统计处理的结果，取双尾t值和p值。

　　2　结果

　　2.1　皮损组织中cgrp的含量测定：应用特异性cgrp放射免疫分析测定，寻常型银屑病慢性斑块型皮损组织提取物中的cgrp含量为27.31pg/200μl，正常人对照组相应部位皮肤组织提取物的cgrp含量为13.47pg/200μl，经t检验，t=2.01,p＜0.01，两者之间统计学分析有显著性差异(见表1)，表明寻常型银屑病慢性斑块型皮损组织的cgrp含量高于正常人对照组。

　　表1　银屑病斑块型皮损及正常人皮肤组织cgrp含量检测结果(pg/200μl)

　　分组例数(n)x±st值p值

　　正常人2813.47±1.65－－

　　银屑病人3227.31±4.412.01＜0.01

　　2.2　皮损组织中cgrp免疫组化染色形态学观察：在寻常型银屑病斑块型皮损中，可见cgrp分布于增厚的表皮和真皮乳头及浅层组织。在真皮乳头毛细血管壁周及内皮细胞有阳性颗粒分布其表面，真皮浅层灶炎性细胞浸润区域的小血管丛间可伴行的神经纤维表达分泌cgrp。在表皮见呈树枝状的cgrp阳性细胞，细胞表面有分枝突起。经连续切片做he染色，未显示此阳性细胞，提示其可能为郎格汉斯细胞。同时，也发现在银屑病斑块型皮损中，cgrp阳性的神经纤维伸入到表皮内，可见呈条索状排列的阳性表达颗粒(图1)。在正常皮肤组织切片未发现同样的cgrp阳性颗粒。用正常兔血清代替cgrp结果为阴性。

　　图1　银屑病斑块皮损cgrp阳性的神经纤维伸入表皮内，

　　可见呈条索状排列的阳性表达颗粒

　　3　讨论

　　降钙素基因相关肽(cgrp)是一种含37个氨基酸残基的神经肽，1982年amara[7]首次在人和哺乳物体内发现，由降钙素基因编码，转录合经不同的剪接接修产生组织特异性的降钙素和cgrp，前者存在于甲状腺c细胞，而cgrp则广泛在于中枢和外周神经系统。在外周神经系统，cgrp主要由感觉神经元合成，分布于无髓鞘的c纤维，存在于人体皮肤。表皮下有单个散在cgrp反应阳性神经纤维，能穿透基底膜进入表皮，真皮深层cgr性神经纤维可从神经束中伸出分枝，到达小血管和汗腺周围，释放cgrp，调节其功能，cgrp成为皮肤重要的感觉神经递质[3]。

　　由于cgrp既是一种有效的血管活性剂，有较强的舒张微血管作用，又能刺激人皮肤微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cell,hdmec)活化，使hdmec分泌趋化因子il－8，诱导内皮细胞与单一核细胞及中性粒细胞的粘作用[5]。因此，cgrp在一系列炎症反应过程中发挥了重要的作用。本实验特异性放射免疫分析结果表明，银屑病斑块型皮损局部组织cgrp的含量27.31pg/200μl，而正常人为13.4pg/200μl，经统计学处理两者有显著性差异，说明寻常型银屑病患者斑块型皮损神经肽cgrp的分泌量比正常人升高。这一实验结果与farber的报道[1,8]相符合。

　　为了确定cgrp在银屑病在患者斑块型皮损区分泌表达的部位和作用的靶细胞，我们用抗生物素蛋白－生物素－过氧化物酶复合物法，进行免疫组化染色观察，结果发现真皮毛细血管壁周及内皮细胞表面有cgrp阳性颗粒分布，真皮浅层灶状炎性细胞浸润区域的微血管丛间，有伴行的神经纤维分泌表达cgrp。而且，增厚的表皮内见条索状排列的阳性表达颗粒和树枝状的阳性细胞，并经连续切片he染色为阴性，提示可能为郎格汉斯细胞。在此基础上，我们进行了双相免疫荧光及激光共聚焦扫描，证实cgrp阳性的树枝状细胞是cd1＋的郎格汉斯细胞(另文发表)。由此可见，神经肽cgrp在银屑病变过程中，对扩张微血管，诱导炎性细胞的局部浸润，影响靶细胞的功能，可能具有十分重要的作用。同时也发现银屑病斑块型皮损的cgrp神经纤维比正常皮肤增多了，一些cgrp阳性神经纤维从真皮的末端进入表皮。这表明银屑病斑块型皮损的病变与cgrp的过度分泌密切相关，但其作用如何有待进一步研究。

　　参考文献：

　　[1] jiang wy, raychoudhuri sp, farber em. double labeled immunofluorescence study of cutaneous nerves in psoriasis[j]. int j dermatol, 1998,37(8):572～ 574.

　　[2] schelzen t, armstrong ca, bunnett nw, et al. neuropepitdes in the skin: interaction between the neuroendocrine and the skin immune system[j]. exp dermatol, 1998,72(2～ 3):81～ 96.

　　[3] hosoi j, murphy ge, egan cl, et al. regulation of langerhans cell function by nerves containing calcitonin gene related peptide. nature[j], 1993, 363(13):159～ 162.

　　[4] torii h, hosoi j, asahina a, et al. calcitonin gene related peptide and langerhans cell function[j]. j invest dermatol,1997,2(1):82～ 86.

　　[5] ansel jc, armstrong ca, song is, et al. interactions of the skin and nervous system[j]. j invest dermatol,1997,2(1):23～ 26.

　　[6] wang x, jones sb, zhou z, et al. cgrp and npy levels are elevated in plasma and decreased in vena cava during endotoxic shock in the rat[j]. cire shock, 1991,36(1):21～ 30.

　　[7] amara sg, jones v, rosenfeld mg. alternative rna processing in calcitonin gene expression generates mrna encoding different polypeptide products[j]. nature, 1982,298(5871):240～ 244.

　　[8] chen j, smaller br, kaychauduri sp, et al. intraepidermal nerve fiber expression of calcitonin gene related peptide, vasoactive intestinal peptide and substance p in psoriasis[j]. arch dermatol res, 1997,289(11):611～ 616.

　　收稿日期：2000-01-24；修回日期：2000-03-17