湛江地区淋球菌流行株质粒谱型的研究

2015-09-30 17:28:22

湛江地区淋球菌流行株质粒谱型的研究

临床皮肤科杂志 2000年第3期第29卷临床及实验研究

作者：李国明　陈群　王胜春

单位：广东医学院微生物学教研室，湛江，524023

关键词：奈瑟氏淋球菌；耐药性；质粒谱

　　摘要：为探讨淋球菌耐药谱与质粒谱之间的相互关系，对1998年～1999年广东省湛江地区分离鉴定出的98株淋球菌，以碱裂解法进行质粒的抽提，并分析质粒谱型的分布情况。结果显示98株淋球菌流行株，检出质粒的有90株，占91.84％；质粒谱型12种，以7.4kb＋4.2kb,39.5kb＋7.4kb＋4.2kb为主，占38.76％。从而揭示湛江地区淋球菌流行株质粒的分布现状，为该地区淋病的分子流行病学研究打下了基础，但质粒谱与耐药性之间的关系尚有待进一步探讨。

study on the plasmid profiles of epidemic neisseria gonorrhoeae strains in zhanjiang

li guoming　chen qun　wang shengchun

　　(department of microbiology, guangdong medical college, zhanjiang, 524023)

　　abstract in order to probe the plasmid profiles(pp) and their distributions of n. gonorrhoeae, the plasmids of 98 gonococcal strains obtained from 1998 through 1999 in zhanjiang(guangdong) were extracted by alkaline lysis technique. then analysis of the distributions of plasmids profiles was performed. the results showed that 90 strains of n.gonorrhoeae harboured plasmids, the detected percentage accounting for 91.84％ . there were 12 types of pp. the pp types of 7.4kb＋ 4.2kb and 39.5kb＋ 7.4kb＋ 4.2kb were prominent(38.76％ ). the study indicated the plasmid distribution of n.gonorrhoeae in zhanjiang and made a basis for the molecular epidemiological study of gonorrhea in this area. the relationship between pp and the resistance to antimicrobials has to be investigated in future.

　　key words neisseria gonorrhoeae drug resistance plasmid profile

　　淋病目前是我国性传播性疾病(std)中发病率最高的病种。随着抗生素的广泛应用，细菌染色体突变及耐药基因的转移等原因，淋球菌对抗生素的耐药日渐增多。单用抗菌药物耐药谱来分析耐药菌株的流行趋势意义不大，它不能区分某一地区的耐药菌株是新近传入株或是原有耐药株的变异。质粒谱分析是近几年用作质粒分析的分子生物学技术，包括琼脂糖凝胶电泳检测细菌的质粒特征和采用限制性内切酶对质粒作同源性分析。耐药谱结合质粒谱分析有助于鉴定不同地区来源的分离株，以及对淋病患者进行耐药性监测和传染源的追踪^[1]。我们对湛江地区1998年～1999年分离鉴定出的98株淋球菌进行了质粒谱的分析研究，现将结果报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　菌株来源：从1998年～1999年本院附属医院、湛江市第二人民医院、湛江农垦中心医院皮肤性病门诊病人中分离鉴定出98株淋球菌。who标准菌株由美国疾病控制中心(cdc)的campbell博士惠赠。

　　1.2　培养基：英国oxiod公司生产的gc琼脂。

　　1.3　质粒抽提：质粒抽提方法参考《分子克隆实验指南》^[2]，并加以改良，具体操作简略为：将24h纯培养的细菌用生理盐水刮洗入eppendof管，离心后的沉淀重悬于100μl预冷的溶液i(25mmol/ltris.hclph8.0,10mmol/ledtaph8.0，溶菌酶10mg/ml)，剧烈振荡，冰浴10min；加200μl新鲜配制的预冷的溶液ⅱ(3％sds，0.2mol/lnaoh)，迅速颠倒混匀2～3次，冰浴5min；再加入150μl溶液ⅲ(5mol/lkac,3mol/lhac)颠倒振荡10s，冰浴1h，8000r/min离心10min，收集上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇抽提1次，取上清，加2.5倍体积的冰乙醇，置－20℃2h,12000r/min离心10min，真空干燥沉淀物，加te40μl，即为粗提质粒dna。

　　1.4　琼脂糖凝胶电泳及质粒分子量大小计算：用tbe缓冲液配制0.8％琼脂糖，按凝胶5v/cm的电压，电泳3～4h，以λdna/hindⅲ作为marker，量取质粒条带在胶上的泳动距离，并拍照。质粒分子量大小的计算，根据标准marker的电泳结果为标准系统，以其相对迁移率为自变量，分子量对数值为因变量建立回归方程，然后以待测质粒条带的迁移来计算其分子量大小。

　　2　结果

　　湛江地区98株淋球菌流行株的质粒检出情况见表1。

表1　湛江地区98株淋球菌质粒检出情况

质粒大小(kb)	检出菌株数	检出率(％)
42.5	11	11.22
39.5	41	41.82
7.4	58	59.16
4.2	66	67.32

　　1998年～1999年湛江地区98株淋球菌质粒谱分布情况见表2。

表2　1998年～1999年湛江地区98株淋球菌质粒谱型分布情况

质粒谱型(kb)	菌株数	构成比(％)
－	8	8.16
39.5	4	4.08
7.4	10	10.20
4.2	7	7.14
42.5	2	2.04
42.5＋4.2	4	4.08
42.5＋7.4	3	3.06
42.5＋7.4＋4.2	2	2.04
39.5＋4.2	15	15.30
39.5＋7.4	5	5.10
39.5＋7.4＋4.2	17	17.34
7.4＋4.2	21	21.42
合计	98	100.00

　　从表1可看出，4.2kb(隐蔽性质粒)和7.4kb质粒检出较高，检出率分别为67.32％和59.16％；从表2中可看出，98株淋球菌未检出质粒的有8株，占8.16％，质粒总检出率为91.84％(90/98)。质粒谱型有12种，以7.4kb＋4.2kb，39.5kb＋7.4kb＋4.2kb，39.5kb＋4.2kb为主，分别占21.42％，17.34％和15.30％。

　　3　讨论

　　对淋球菌质粒的研究始于20世纪70年代。1973年美国的englkirk首次从1例淋病患者中检测到4.2kb隐蔽性质粒，以后陆续检测到耐青霉素质粒(非洲型5.3kb、亚洲型7.4kb和4.9kb(多伦多型)、高度耐四环素质粒(42.5kb)和接合型质粒(39.5kb)^[3]。

　　淋球菌携带质粒存在明显的地区差异性。杨晓燕^[4]等人(1995年)对重庆地区100株淋球菌所携带的质粒进行了分析研究，质粒总检出率为92.0％，李桂娥^[5]等(1996年)对新疆192株淋球菌进行了质粒分析研究，质粒总检出率为91.66％。我们对湛江地区(1998年～1999年)的98株淋球菌进行了质粒检测，总检出率为91.84％。虽然3个地区质粒总检出率基本一致，但各种质粒的分布却相差甚远。如重庆地区，检出42.5kb质粒18％，39.5kb质粒52％，4.2kb质粒86％，耐药质粒以“亚洲型”为主(分子量为5.6kb)，检出率为36％；新疆地区，检出39.5kb质粒33.33％，4.2kb质粒91.66％，耐药质粒中，“亚洲型”(7.4kb)占19.79％，“非洲型”(5.3kb)占7.29％；湛江地区，42.5kb质粒检出率为11.22％，39.5kb质粒占41.82％，4.2kb质粒检出67.32％，耐药质粒(7.4kb)检出59.16％。这些耐药质粒与淋球菌耐药性的关系尚不清楚。

　　42.5kb质粒携带tetm基因，介导高水平耐四环素，过去认为此质粒是由39.5kb质粒获得tetm基因而形成，但gascoyne等报道，这两种质粒的限制酶图谱明显不同，目前认为39.5kb质粒和42.5kb质粒并无同源性。39.5kb质粒与7.4kb耐青霉素质粒密切相关。lind报道，81％带7.4kb质粒的耐青霉素淋球菌(ppng)同时具有39.5kb质粒^[6]。我们的实验结果显示，58株带7.4kb的淋球菌同时具有39.5kb质粒的有22株，表明39.5kb质粒可能和7.4kb质粒传递有关。4.2kb隐蔽性质粒可在大多数菌株中检测到，我们本次检出率为67.32％(66/98)，其意义不清。korch等的实验证明，淋球菌的隐蔽性质粒能整合于细菌染色体上(包括无质粒菌株)，重组菌可发生菌毛、外膜蛋白等抗原性的改变^[7]。

　　我们将湛江地区的98株淋球菌进行了质粒谱的分型，共分12型，，其中以7.4kb＋4.2kb和39.5kb＋7.4kb＋4.2kb这两种为主，分别占21.42％和17.34％，进一步了解质粒谱型与耐药性的关系，尚需由质粒的转化、接合及质粒的消除试验加以证实(对此，作者另文报道)。淋球菌质粒谱作为淋病流行病学监测的工具，其敏感性还不够，质粒谱除了与耐药谱联用外，尚需与其它分型方法结合使用，如血清学分型、营养分型，这样可以提高监测的敏感性，从而提供更多的流行病学信息。

　　本课题得到广东省卫生厅"五个一工程"基金资助(.9601)

　　参考文献

　　1，marrommati l, tzelepi e, sima a, et al. antibiotic resistance, plasmid content and auxotypes of neisseria gonorrhoeae in greece. j antimicrob chemother, 1988, 21(2):571～ 576

　　2，maniati t， fritsch ef, sambrook j, molecular cloning: a laboratory manual cold spring harbor, n.y. cold spring harbor

　　laboratory, 1982. 368～ 369

　　3，李国明(综述).淋球菌耐药性及r质粒的研究进展.广东医学院学报，1999，17(1)：40～42

　　4，杨晓燕，朱道银.淋球菌质粒及其与耐药性的关系的研究.中国皮肤性病学杂志，1997，11(3)：135～137

　　5，李桂娥，董雅荣，马吉，等.产β内酰胺酶淋球菌与青霉素编码质粒介导的耐药性.中国皮肤性学病学杂志，1997，11(4)：202～203

　　6，lind i, arborio m, bentzon mw. the epidemiology of neisseria gonorrhoeae isolates in daker, senegal 1982～ 1986: antimicrobial resistance auxotype and plasmid profiles. genitourin med, 1991, 67(1):107～ 112

　　7，hagblom p, korch c, jonesson ab, et al. intragenic variation by site specific recombination in the cryptic plasmid of neisseria gonorrhoeae. j bacteriol, 1986, 167(2):756～ 761

　　(收稿 1999- 10- 06 修回 1999- 12- 21)