维吾尔族长寿老人及其家系apoE基因多态性分析

2015-09-30 21:42:37

　　维吾尔族长寿老人及其家系apoe基因多态性分析

　　中华老年医学杂志 1999年第3期第18卷临床研究

　　作者：王新利　王国荃　杨春荣

　　单位：830054 乌鲁木齐市，新疆医科大学环境卫生教研室〔王新利（现在100083 北京医科大学儿童青少年卫生研究所）、王国荃、杨春荣〕

　　关键词：载脂蛋白e类；等位基因；长寿

　　【摘要】　目的　探讨载脂蛋白e（apoe）基因多态性与人类寿命的关系。　方法　采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（pcr-rflp）技术，调查了35名维吾尔族（维族）长寿老人、7个维族长寿家族的apoe基因频率分布情况，并与163名维族青年和9个维族非长寿家族进行了对比分析。　结果　维族长寿老人及长寿家族的apoe等位基因ε4的频率分别为0.057和0.059，青年对照组为0.138，非长寿家族为0.161。长寿老人与青年对照、长寿家族与非长寿家族ε4频率相比，差异均有显著性（p＜0.05）。　结论　apoe基因ε4携带者的平均寿命低于其他等位基因携带者。

　　an analysis of apolipoprotein e gene polymorphisms in uygur long-lived subjects and their family members

　　wang xinli, wang guoquan, yang chunrong. department of environment health, xinjiang medical university，urumqi 830054

　　【abstract】　objective　to study the relationship between apolipoprotein e (apoe) alleles and life-span. 　methods　the apoe genotypes were analyzed with pcr-rflp in 35 aged of 90 years and over, the members of 7 longevity families and 9 control families and 163 young uygurs who were healthy blood donors. 　results　the apoe ε4 allele frequency in the four groups was 0.057, 0.059, 0.161, 0.138, respectively. a significantly lower ε4 allele frequency was found in the aged and the members of the longevity families than in the young uygurs and the members of the control families(p＜0.05). 　conclusions　apoe genotype may have impact on human longevity.

　　【key words】　apolipoproteins e alleles 　　 longevity

　　已有足够的证据证明人类的寿命受多基因控制〔1〕，但有关其遗传标记问题，迄今仍所知甚少，目前仅人类组织相容性抗原（hla）系统被认为与人类寿命有明确关系〔2〕。鉴于心血管疾病是人类死亡的主要原因之一，近年来国外在对有关心血管疾病遗传标记问题的研究中发现，未患冠心病的长寿（≥90岁）人群，apoe等位基因ε4的频率明显低于正常血脂的青年对照组〔3，4〕，因此国外有学者提出apoe基因可能与人类寿命有关。我们于1997年4月至1998年3月，对35名维吾尔族（维族）长寿老人、7个维族长寿家族apoe基因频率分布情况进行了分析，探讨apoe基因与人类寿命的关系。

　　资料与方法

　　一、检测对象

　　1.长寿老人：为35名维族人，从乌鲁木齐市人口计算机管理系统获得,并逐户按档案法、逻辑推理法、观察法、比较法综合判定核实年龄，年龄90～100岁；男23名，女12名。青年对照组为163名维族健康献血员,年龄20～35岁；男81名,女82名。

　　2.长寿家族：对长寿老人的遗传史和一般健康状态进行调查后, 选出7名身体健康、全家愿意合作,且家族两代人中均有寿命大于90岁的老人所在家族定为长寿家族；非长寿家族选同一住宅区、同一民族、工作性质、经济收入与长寿家族成员相似，先证者父母双方寿命小于70岁，家族史中无寿命大于80岁者，其所在家族定为非长寿家族,共9个。长寿家族成员93名，年龄7～100岁，男48名，女45名；非长寿家族成员62名，年龄8～66岁，男30名，女32名。

　　二、方法

　　1.apoe基因检测：全部受试者采早晨空腹肘静脉血0.5 ml acd抗凝，蛋白酶k消化后，酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀dna，75%乙醇漂洗2遍，dna溶于200 μl te缓冲液(ph=8.0)中。聚合酶链反应(pcr)引物按emi等〔5〕报道设计，位于apoe第4个外显子内，涵盖2个多态位点，由上海植物生理研究所合成，其上游引物序列为5'-acagaattcgccccggcctgctacac-3'，下游引物序列为5'-taagcttggcacggctgtccaagga-3'，pcr反应体积为50 μl，含10×buffer 5 μl，4×dntp 200 μmol/l，引物各25 pmol/l，基因组dna约0.5 μg及10%二甲基亚酚。首先96℃预变性10分钟，然后加入2 u taq酶（华美公司提供），按94℃变性40秒，复性61℃ 40秒，延伸71℃ 1分钟，循环30次，最后一个循环72℃延伸5分钟（dna 扩增仪型号biorad genecyclertm）。pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射灯下进行检测，在244 bp处出现荧光带为特异性pcr产物。在pcr扩增产物中加入10 u核酸内切酶 hhaⅰ（美国promega公司产品），37℃酶切4小时，酶切产物直接加入8%聚丙烯酰胺凝胶中，于200 v恒压下垂直电泳3小时，0.5 μg/ml溴乙啶染色30分钟。紫外线透射灯下观察结果。

　　2.统计方法：等位基因频率按文献〔6〕方法计算。基因型及等位基因频率比较采用χ2检验。

　　结　　果

　　一、 pcr 扩增产物和hhaⅰ酶切apoe产物电泳结果

　　见图1、2。pcr扩增产物位于apoe基因第4外显子内，涵盖2个突变位点，产物长度244 bp。纯合子e2/2在91、83 bp出现荧光条带；e3/3在91、48 bp出现荧光条带；e4/4在72、48 bp出现荧光条带，杂合子e4/2出现91、83、72、48 bp条带；e3/2出现91、83、48 bp条带；e4/3出现91、72、48 bp条带。

　　m：pcr分子量参照物　泳道1～ 6是pcr扩增产物

　　图1　apoe基因pcr扩增产物电泳图

　　m:pgem-72f（+）/hae111分子量参照物　泳道1～6依次代表基因型ε4/4、ε4/3、ε4/2、ε3/2、 ε2/2、ε3/3

　　图2　hhaⅰ酶切apoe基因pcr产物的电泳图

　　二、长寿老人apoe基因型及等位基因频率

　　维族长寿老人与青年对照组apoe基因型及等位基因频率比较见表1。在基因型分析中，维族长寿老人与对照人群均以e3/3型最常见，但e4基因携带者（包括e4/4、e4/3、e4/2）长寿老人低于对照组。基因频率分析显示，ε4等位基因相对频率长寿老人与对照组差异也有显著性。在长寿老人中，等位基因ε2、ε3 的相对频率虽高于对照组，但差异无显著性。

　　表1　维族长寿老人与青年对照组apoe基因型及等位基因频率比较

　　组别例数apoe基因型频率(%)ε4ε3ε2

　　e4/4e4/3e2/4e3/3e2/3e2/2

　　长寿老人组350　　11.43＊074.2814.2800.057＊0.8710.071

　　青年对照组1630.6125.770.6163.808.590.610.1380.8100.052

　　注：χ2检验，与对照组比较，*p＜0.05

　　三、长寿家族与对照家族apoe基因型及等位基因频率

　　维族长寿家族与对照家族apoe基因型及等位基因频率比较见表2。长寿家族与非长寿家族成员相比，在基因型和等位基因频率分布上差异亦有显著性，长寿家族e4基因携带者，即e4/4、e4/3、e4/2 及等位基因 ε4的相对频率均显著低于非长寿家系；等位基因ε3的相对频率长寿家族高于非长寿家族；等位基因ε2差异无显著性。

　　表2　维吾尔族长寿家族与非长寿家族基因型及基因频率比较

　　组　别例数(apoe基因型频率(%)ε4ε3ε2

　　e4/4e4/3e2/4e3/3e2/3e2/2

　　长寿家族成员93011.83＊＊075.2712.9000.059＊＊0.876＊0.065

　　非长寿家族成员621.6127.421.6158.0611.2900.1610.7740.065

　　注：χ2检验，与非长寿家族成员比较，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01

　　讨　　论

　　载脂蛋白e是血浆中乳糜微粒（cm）、极低密度脂蛋白（vldl）及中间密度脂蛋白（idl）与apoe受体或apob、e受体结合的连接物〔3〕。它由人类第19号染色体长臂上的一个基因位点的3个常见等位基因所编码，由于具有共显性遗传的特点，人群中有6种不同的基因型，相对应的也有6种表型，3种纯合子（e2/2、e3/3、e4/4）和3种杂合子（e2/4、e2/3、e3/4）〔5〕。不同基因编码出的apoe同分异构体与受体的结合活性及自身在体内的代谢过程均存在一定差异。因此，apoe在调节血脂、脂蛋白在体内的代谢方面起着非常重要的作用〔7〕。

　　近年来对有关心血管疾病遗传标记问题的研究发现，在未患冠心病的80岁以上人群中，apoe等位基因ε4的频率明显低于血脂正常的青年对照组〔3〕；而在冠心病患者中，ε4的频率明显增高，其中携带e4/4基因型者年龄较其他基因型（包括e4/3）平均小5岁〔8〕。不仅如此，最近研究显示，在散发和家族性老年性痴呆（ad）患者中，ε4携带率也明显高于对照组〔9〕，而一项瑞典的痴呆病研究表明，患ad的老年人3年病死率为42.2%〔4〕。上述研究均提示，apoe基因多态性可能与人类寿命有关。

　　本资料结果表明，维族长寿老人中apoe等位基因ε4的频率明显低于青年人群，与长寿家族中apoe等位基因频率分布相同。青年人群apoe等位基因ε4、ε3的相对频率介于长寿老人及长寿家族与非长寿家族之间。分析原因，青年维族人群中包括一部分有可能成为长寿老人者；而在非长寿家族中，由于我们选择的是家族中近2代人中无70岁以上者的家族，因此这一家族的个体成为长寿老人的概率是很小的，所以在非长寿家族中等位基因ε4频率最高。等位基因ε3的频率在维族长寿老人中虽高于青年人群，但可能由于样本量偏少而无统计学意义，在维族长寿家族中，等位基因ε3频率明显高于非长寿家族。法国的一项研究发现，在百岁老人中等位基因ε4的频率降低的同时，ε2的频率明显增高〔4〕。在本资料中，维族长寿人群和长寿家族中等位基因ε2与非长寿组相比差异均无显著性。

　　上述结果提示，apoe 3种常见等位基因与人类寿命有关，ε4携带者寿命可能低于其他等位基因携带者。目前普遍认为，由于e4可增高血清中总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平，从而提高了冠心病和ad的发病率，使e4携带者难以达到预期寿命〔3,4,7〕。但是近年来研究还发现，淋巴细胞表面有apoe免疫调节受体，提示apoe在免疫反应中可能有一定的调节作用〔10〕。因此，有关apoe基因多态性与人类寿命的关系尚待从不同方面进一步深入研究。

　　参考文献

　　1　袁朝辉, 朱慧. 控制人类寿命基因数量估计. 中国老年学杂志，1997，2：127.

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　　6　杜传书，主编. 医学遗传学基础. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1989. 91-93.

　　7　walden cc, hegele ra. apolipoprotein e in hyperlipidemia. ann intern med， 1994, 120：1026-1036.

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　　9　poirier j, davignon j, bouthillier d, et al . apolipoprotein e polymorphism and alzheimer's disease. lancet, 1993, 342：697-699.

　　10　mistry mj, clay ma, kelly me, et al. apolipoprotein e restricts interleukin-dependent t lymphocyte proliferation at the g1a/g1b boundary. cell immunol, 1995, 162：14-23.

　　(收稿：1998-08-04　　修回：1999-03-15)