新疆维吾尔族长寿老人及长寿家族apoE等位基因频率分析1

2015-09-30 21:42:41

　　新疆维吾尔族长寿老人及长寿家族apoe等位基因频率分析1

　　中国老年学杂志 1999年第2期第19卷实验研究

　　作者：王新利　王国荃　徐臻荣　西奋功2

　　单位：新疆医学院环境卫生学教研室，乌鲁木齐　830054

　　关键词：apoe等位基因；长寿；维吾尔族

　　摘　要　目的　探讨apoe基因多态性与人类寿命的关系。方法　采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(pcr-rflp)技术，对35名维吾尔族长寿老人，7个维吾尔族长寿家族，并以163名维吾尔族青年和9个维吾尔族非长寿家族作为对照组，对他们的apoe基因频率分布特征进行了对比分析。结果　维吾尔族长寿老人及长寿家族的apoe等位基因ε4的频率明显低于普通青年人群和非长寿家族。结论　ε4携带者的平均寿命低于其它等位基因携带者。

　　已有足够的证据证明人类的寿命是受多基因控制〔1〕，但有关其遗传标记问题，迄今为止仍所知甚少，目前仅hla系统被认为与人类寿命有明确关系〔2〕。鉴于心血管疾病是人类死亡的主要原因之一，近年来国外在对有关心血管疾病遗传标记问题的研究发现，在免患冠心病而幸存至高龄的人群中，apoe等位基因ε4的频率明显低于正常血脂的青年对照组〔3，4〕，因此国外有学者提出apoe基因可能与人类寿命有关。但国内尚缺乏类似报道，为此我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(pcr-rflp)技术，对35名维吾尔族长寿老人，7个维吾尔族长寿家族，并以163名维吾尔族青年和9名维吾尔族非长寿家族作为对照组，对他们的apoe基因频率分布特征进行了对比分析，探讨apoe基因与人类寿命的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象

　　1.1.1　长寿老人和青年组　35名＞90名的维吾尔族长寿老人，从乌鲁木齐市人口管理计算机系统获得，并逐户按挡案法，逻辑推理法，观察法，比较法，综合判定核实年龄。男23名，女12名。163名维吾尔族青年对照组来自健康献血员，年龄20～35岁，男81名，女82名。

　　1.1.2　长寿家族和非长寿家族　经对35名≥90岁的维吾尔族长寿老人的遗传史和一般健康状态调查，选出了7名身体健康，全家愿意合作，且家族史中有两代人寿命≥90岁的老人所在家族定为长寿家族。非长寿家族选同一住宅区，同一民族，工作性质，经济收入与长寿家族成员相似，先证者父亲双方寿命小于70岁，家族史中无寿命大于80岁者，其所在家族定为非长寿家族，共9个。上述家族成员共155名，年龄7～100岁，男78名，女77名。

　　1.2　主要试剂　pcr引物f4(5-acagaattcgccccggcctgctacac-3)，f6(5-taagcttggcacggct

　　gtccaagga-3)，由上海植物生理研究所合成(按emi等〔4〕报道设计)。四种脱氧核糖核苷酸(4×dntp)购自上海华美生物工程公司。taq dna聚合酶购自上海华美生物工程公司。hha ⅰ核酸内切酶为promega公司产品。pgem-72f(+)/heaⅲ dna参照物购自上海华美生物工程公司。

　　1.3　主要仪器　pcr amplier(biorad genecyclertm)，电泳仪(biorad power/dac 300)。

　　1.4　方法　全部受试者采早晨空腹肘静脉acd抗凝血0.5 ml，蛋白酶k消化后，酚、氯仿抽提，异丙醇沉淀dna，75%乙醇漂洗2遍，dna溶于200 μl te(ph=8.0)中。pcr扩增目的基因，pcr反应体积50 μl，含10× buffer 5 μl，4× d ntp 200 μmol/l，引物各 25 pmol/l，基因组 dna 约 0.5 μg 及10%dmso。首先96 ℃预变性10 min，而后加入1 μl(2.5 u)，taq酶(华美公司提供)，按94 ℃变性40 s，复性61 ℃40 s，延伸71 ℃1 min，循环30次，最后一个循环72 ℃延伸5 min。pcr产物经1.5%琼脂糖凝脉电泳，紫外线透射灯下进行检测在244 bp处出现荧光带，为特异性pcr产物(见图1)。在pcr扩增产物中加入10 u hhai，37 ℃酶切4 h，酶切产物直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶浓度为8%，于200 v恒压下垂直电泳3 h，0.5 μg/ml溴乙啶中染色30 min，紫外线透射灯下观察结果(见图2)。

　　图1　pcr扩增产物：位于apoe基因第4个外显子中，涵盖两个多态性位点，片段长度244 bp。泳道1，2，3，4，5，6是pcr产物，m：pcr maker

　　图2　hhaⅰ酶切apoe pcr产物的实验图1，2，3，4，5，6分别代表基因型，ε4/4，ε4/3，ε4/2，ε3/2，ε2/2，ε3/3，m：pgem-72f(+)/heaⅲdna参照物　　纯合子e2/2在91和83 bp出现荧光条带；e3/3在91，48 bp出现荧光条带；e4/4在71和48 bp出现荧光条带，杂合子e4/2出现91、83、72、48 bp条带；e3/2出现91，83和48 bp条带；e4/3出现91，72和48 bp条带。

　　1.5　统计方法　等位基因频率计算方法：按hardy-weinberg equilibrium计算，等位基因频率比较采用卡方检验。

　　2　结　果

　　2.1　维吾尔族长寿老人与普通对照人群apoe基因型及等位基因频率比较　见表1。

　　表1　维吾尔族长寿老人与普通对照人群apoe基因

　　型及等位基因频率比较

　　维族长寿老人(n=35)对照人群(n=163)

　　e4/401(0.61%)

　　e4/44(11.4%)42(25.8%)

　　e2/401(0.61%)

　　e3/326(74.3%)104(63.8%)

　　e2/35(14.3%)14(8.5%)

　　e2/201(0.61%)

　　ε40.057(4)0.138(45)

　　ε30.871(61)0.810(264)

　　ε20.0714(5)0.052(17)

　　基因型lr：χ2=4.329，p=0.037，基因频率lr：χ2=0.484，p=0.043

　　在基因型分析中，维吾尔族长寿老人与普通对照人群均以e3/3型最常见，但e4基因携带者((包括e4/4 e4/3 e4/2)长寿老人低于对照人群，且存在统计学差异(likeihood ratio lr χ2=4.329，df=1，p＜0.05)。等位基因频率分析显示：ε4等位基因相对频率长寿老人与对照组相比(5.7%对13.8%)也存在统计学差异(lr χ2=4.084，p=0.043 5)。在长寿老人中等位基因ε2、ε3的相对频率虽高于对照组但未达统计学意义(p＜0.05)。

　　2.2　维吾尔族长寿家族与对照家族apoe基因型及等位基因频率比较　见表2。

　　长寿家族与对照家族相比，在基因型和等位基因频率分布上同样存在统计学差异，长寿家族e4基因携带者即e4/4、e4/3、e4/2低于对照家族(lr χ2=10.709，p=0.001)。ε4的相对频率为5.9%，而对照家系为16.1%(lr χ2=8.435，p=0.004)，ε3的相对频率长寿家族高于对照家族(87.6%对77.4%，lr χ2=5.538，p=0.019)。ε2未表现出统计学差异。

　　表2　维族长寿家族与对照组家族基因型及基因频率比较

　　长寿家族(n=93)对照家族(n=62)

　　e4/401

　　e4/41117

　　e2/401

　　e3/37036

　　e2/3127

　　e2/200

　　ε40.05910.1612)

　　ε30.8760.7741)

　　ε20.06450.0645

　　注：基因型 lr χ2=8.350，df=2，p=0.015　基因频率 lr χ2=8.503，df=2，p=0.014

　　两组相比 1)p＜0.05，2)p＜0.01

　　3　讨　论

　　载脂蛋白e(apoe)是血浆中乳糜微粒(cm)，极低密度脂蛋白(vldl)及中间密度脂蛋白(idl)与apoe受体或apob、e受体结合的连接物〔3〕。它由人类第19号染色体长臂上的一个基因位点的三个常见等位基因所编码，由于具有共显性遗传的特点，人群中有6种不同的基因型，相对应的也有6种表型，三种纯合子(e2/2，e3/3，e4/4)和三种杂合子(e2/4，e2/3，e3/4)〔5〕。不同的基因编码出的apoe同分异构体，其与受体的结合活性及自身在体内的代谢过程均存在一定差异。因此apoe调节血脂、脂蛋白在体内代谢方面起非常重要的作用〔6〕。

　　近年来对有关心血管疾病遗传标记问题的研究发现，在免患冠心病而幸存至高龄的人群中，apoe等位基因ε4的频率明显低于正常血脂的青年对照组〔3〕，而在冠心病病人中ε4的频率明显增高，其中携带有e4/4基因型的冠心病病人的年龄较其它基因型(包括e4/3)的冠心病患者年龄平均小5岁〔7〕。不仅如此，最近研究显示在散发和家族性老年痴呆病ad患者中ε4携带率也明显高于对照组〔8〕，而一项瑞典的痴呆病研究表明患ad的老人3年死亡率为42.2%〔4〕。上述研究均显示apoe基因多态性可能与人类寿命有关。

　　本研究表明，维吾尔族长寿老人中apoe等位基因ε4的频率明显低于普通青年人群，与长寿家族中apoe等位基因频率分布相同。普通人群apoe等位基因ε4、ε3的相对频率界于长寿老人及长寿家族与对照家族之间，分析原因，普通维吾尔族人群中，包括一部分有可能成为长寿老人的频率，而在对照家族中，由于我们选择的是家族中近二代人中无70岁以上者的家族作为对照家族，因此这一家族的个体成为长寿老人的概率是很小的，所以在对照家族中等位基因ε4频率最高。等位基因ε3的频率在维吾尔族长寿老人中虽高于二组对照人群，但由于样本量过少而没有统计学意义，在维吾尔族长寿家族中，等位基因ε3频率明显高于对照组。新近法国的一项研究发现在百岁老人中等位基因ε4的频率降低的同时，ε2的频率明显增高〔4〕。在我们的研究中维吾尔族长寿人群和长寿家族中等位基因ε2与两组对照组相比均无统计学差异。

　　本研究结果提示apoe三种常见等位基因与人类寿命有关，ε4携带者寿命可能低于其它等位基因携带者。目前大多数研究〔3，4，6，7〕认为由于e4可增高血胆固醇及ldl-c水平，从而提高了chd和ad的发病机率，因而使e4携带者难以达到预期寿命。但是近年来研究还发现淋巴细胞表面有apoe免疫调节受体。提示apoe在免疫反应中可能有一定的调节作用〔9〕。因此，我们认为有关apoe基因多态性与人类寿命的关系尚有待于从不同方面进一步深入研究。

　　1　新疆自治区科委资助课题(95908)

　　2　新疆自治区农科院

　　作者简介：王新利，女，36岁，博士，主治医师，从事基因与血脂研究

　　4　参考文献

　　1　袁朝辉，朱　慧.控制人类寿命基因数量估计.中国老年学杂志，1997；17(2)：127

　　2　takata h，suzuki m.influence of major histocompatibility complex region genes on human longevity among orinawan-japanese centenarians and nonagenarians .lancet，1987；10：826

　　3　davignon j，gregg re，sing cf.apolipoprotein e polymorphism and atherosclerosis.atherosclerosis，1988；8：1

　　4　van bockxmeer fm.apoe and ace genes:impact on human longevity.nature genetics，1996；6：4

　　5　emi m，wu ll,robertson ma et al.gene typing and sequence analysis of apolipoprotein e isoforms.genomics,1988；3：373

　　6　walden cc，hegele ra.apolipoprotein e in hyperlipidemia.ann intern med，1994；120(12)：1026

　　7　peter wf，myers rh.apolipoprotein e alleles,dyslipidemia and coronary heart disease.jama，1994；272(21)：1666

　　8　poirier j，davignon j,bouthillier d et al.apoliprotein e polymorphism and alzheimer's disease.lancet，1993；342：697

　　9　mistry mj，clay ma,kelly me et al.apolipoprotein e restricts interleukin dependent t lymphocyte proliferation at the g1a/g2b boundary.cellular immunol，1995；162：14

　　〔1998-06-05收稿　1998-09-20修回〕