脑脊液（CSF）靠近中枢神经系统的脑实质，可以反映出CNS炎症性疾病，如多发性硬化（MS）的免疫病理。多参数流式细胞仪可确定MS患者脑脊液的免疫改变。

近期Alvermann教授在JAMA Neurology发表文章，通过检索MEDLINE中1980~2013年发表的、用流式细胞术对MS患者脑脊液白细胞亚群进行用研究的文献。系统阐明MS脑脊液的细胞改变，将MS与生理状态、其它CNS疾病相鉴别；将相关发现整合进CNS白细胞转运的模型中；强调治疗相关的白细胞亚群的改变；评估脑脊液免疫表型，寻找新型MS生物标记物。

所有文献均显示，MS可见脑脊液细胞增多。有趣的是，脑脊液富含辅助性T细胞（TH1 和TH17亚型）和调节性T细胞；鞘内B细胞的分化导致浆母细胞和浆细胞产生抗体；其它的白细胞类型，包括自然杀伤细胞、单核细胞和树突状细胞亦有改变。

阐明脑脊液的细胞改变增进了我们对MS病理的认识，为个体化的预后和治疗决策提供了生物标记物的相关信息。然而，多数报道缺乏证明有效性的对照设计。

随着科技的进步，MS脑脊液细胞的免疫表型与不同疾病阶段（活动期和缓解期）的细胞亚群的关系将变得日益重要。应将评价脑脊液细胞数量和成分纳入临床试验的研究。

MS是CNS脱髓鞘性病变，被认为是一种自身免疫性疾病；以脑和脊髓的炎症损害为病理特征。由于活检的副作用，CNS组织并不能常规获取做出诊断；相反，脑脊液易于获得且能反映出脑实质内的细胞变化。研究脑脊液细胞的免疫表型可以从病理生理学的角度，提高诊断的精确性，改善对患者预后的评估。

外周血（PB）分析可以鉴别CNS特异性免疫病理和全身性疾病。多参数流式细胞技术检测悬浮液中细胞表型的金标准，已被用于多种神经疾病的脑脊液细胞分析中。由于MS患者仅有轻度的脑脊液细胞增多，细胞数目较少可能限制了流式细胞术的使用；因此大多数研究都关注于已经明确的细胞亚群，缺少对脑脊液细胞成分的全面分析。

本文中，我们系统回顾了MS患者、健康者以及其它CNS疾病患者脑脊液和外周血的细胞学改变；此外，文章还强调了复发-缓解型（ RRMS）、继发-进展型（SPMS）、原发-进展型（PPMS）等MS临床亚型的差异以及治疗效应；最后，我们评估了脑脊液免疫表型对寻找新型MS生物标记物的作用。

一、MS的白细胞数量

T细胞

正常生理状态下和MS时，T淋巴细胞是脑脊液中主要的细胞类型。与健康者相比，MS患者脑脊液中包含激活的和大量增生的T细胞，反映出存在炎症。与非炎症性的神经系统疾病相比，MS的脑脊液显示辅助性T细胞（helper T cells，TH）为主，伴随CD4:CD8比率的增高。

与外周血相比，脑脊液中富含TH1，TH17和 IL-17分泌型γδ T 细胞（表1）；这些细胞类型在局部炎症机制中起着重要的作用。

复发-缓解型MS可见代偿性CD4+调节性T细胞（regulatory T cells，Treg），但继发-进展型MS则缺乏此种细胞。MS中，CD4+Treg和CD8+Treg细胞的功能均有损害。复发-缓解型MS可见表达CD31的T细胞（提示细胞刚才胸腺释放出来）减少；由于CD31+细胞可抑制Treg细胞，降低胸腺输出功能，这可能是Treg细胞功能损害的原因之一。

MS脑脊液中可见丰富的HLA-G+Treg细胞，但非炎症性神经病变中无此现象；与常规Treg细胞不同，这些细胞行使正常的调节功能。

在MS和非炎症性神经病变中，脑脊液中T细胞大多数为抗原刺激过的T细胞（antigen-experienced T cells）；外周血中主要为初始T细胞（naive T cell）（表2）。大部分的研究表明，脑脊液中的主要亚群为中枢记忆性T 细胞（central memory T cells， TCM cells），此类细胞可归巢至次级淋巴器官中，有监控功能而无即刻的效应作用。

另一些研究表明，脑脊液中还富含效应记忆性T细胞（T cells with an effector memory， TEM cells）；与非炎症性神经病变相比，该细胞类型在炎症性中枢神经疾病中增加。外周血中，CD4+效应记忆性T细胞的比率与MRI监测的MS疾病活动程度相关。

表1.  MS的T细胞数量

表2. MS的记忆性T细胞和激活的标记物

注释：MHC：major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体；NIND：noninflammatory neurological diseases，非炎症性神经疾病

B细胞

尽管生理状态下，脑脊液中缺少B细胞、浆母细胞和浆细胞，但MS的脑脊液中可见这些细胞（表3）。MS脑脊液中B细胞的平均百分比约为5%，B细胞与单核细胞的比率越高，则说明疾病在快速进展。MS患者脑脊液中的B细胞多数为切换的记忆B细胞（class-switched memory cells），浆母细胞百分数约为30%；与其它神经炎症性病变相反，MS浆母细胞的高比率将稳定而持续。

脑脊液中可见具有生发中心表型（germinal center phenotype）的细胞群，但外周血中缺如；提示这些细胞来自于鞘内异位淋巴滤泡。靠近CNS脑实质的近端淋巴组织通过增加在自身抗原中的暴露，促进自体免疫的过程。

表3.  MS的B细胞数量和标记物

注释：: CIS：clinically isolated syndrome，临床孤立综合征；

自然杀伤细胞（Natural Killer Cells）

CNS自体免疫中自然杀伤细胞的免疫调节作用正日益受到关注。一些研究发现，MS患者的自然杀伤细胞的数量下降和功能受损（表4）。赛尼哌治疗时，脑脊液中含有丰富、增多的免疫调节性CD56bright自然杀伤细胞。

表4.  MS的NK细胞数量和标记物

单核细胞

单核细胞是正常脑脊液的主要细胞成分，MS时常显著性降低。与外周血相比，脑脊液中的单核细胞常表达非典型性MHC分子HLA-G。HLA-G+单核细胞为耐受型，可能参与正常生理状态下CNS抑制性免疫微环境。

表5.  MS的单核细胞数量和标记物

树突状细胞（Dendritic Cells，DC）

2001年Pashenkov等人首次报道了脑脊液中存在树突状细胞。MS患者脑脊液中树突状细胞的数量在疾病早期最高，但随着病程的延长而减少（表6）。与外周血相比，脑脊液中的髓样树突状细胞（Myeloid DCs）的表达高水平的HLA-DR和共激分子，提示可强烈刺激T细胞。

MS患者的浆细胞样树突状细胞，在外周血和脑脊液中具有相同的表型，但都偏向前炎症CD123low亚群，该亚群可引起TH17细胞的反应。

表6.  MS的DC数量和生物标记物

二、白细胞迁移的标记物

白细胞向CNS 的迁移是MS研究的重点，一些研究关注于趋化因子和粘附分子（表7）。白细胞向CNS迁移的可能机制如图所示。

表7.  MS白细胞迁移的标记物

图. 白细胞向CNS迁移的途径和相关白细胞-内皮细胞相互的作用：从实质血管中穿越血脑屏障进入CNS脑实质（A）；从软脑膜血管进入蛛网膜下腔（B）；通过脉络丛进入脑室脑脊液中；趋化因子-趋化因子受体的相互作用有助于脑脊液中白细胞隔离（D）。

CXCR3是MS中被研究的最多的趋化因子；与外周血相反，它主要表达在脑脊液的大部分T细胞上，提示其主要作用为白细胞隔离。大部分的脑脊液T细胞还表达CCR7，这是中心记忆性T细胞的标记物，参与淋巴器官的归巢机制。事实上，脑脊液的作用可视为CNS中的淋巴。

Sato等人的最新研究显示，MS急性复发期的患者，脑脊液中含有丰富的同时表达CCR2和CCR5的自身反应性T细胞，但在其它炎症性CNS病变中缺如。值得注意的是，脑脊液中仅含丰富的CCR2+CCR5+CCR6− TH1细胞亚群，CCR6+TH17细胞缺如。

然而，其它研究显示，临床孤立综合征患者的脑脊液中富含CCR6+T细胞，这可能提示为CNS自体免疫的未成熟状态。CCR6参与疾病的启动机制，促使T细胞通过脉络丛进入脑脊液。

关于白细胞亚群其它趋化因子受体的研究数据较少。但是，趋化因子CXCL13，在MS患者脑脊液中增多，被认为通过其CXCR5受体从而参与B细胞的募集机制。

与外周血相比，脑脊液中多数粘附分子的表达增多，它们的表达模式在MS患者、无菌性脑膜炎和健康对照者中类似，提示着募集具有普遍性的机制。实际上，VLA-4在脑脊液中所有的TH细胞上均有表达，对于T细胞向CNS的迁移十分重要。

三、治疗效应对白细胞亚群的影响

随着单克隆抗体的发展，一些研究关注于MS治疗的免疫效应（表8）。抗VLA-4抗体那他珠治疗可引起脑脊液中T细胞和B细胞的持续性减少；而未经治疗的患者，外周血中含有丰富的、表达激活的促炎表型的T细胞，可通过细胞隔离作用进入CNS。

芬戈莫德治疗可引起循环中CD4+和CD8+T细胞、B细胞的减少，而脑脊液中仅CD4+ T细胞减少。尽管那他珠单抗和芬戈莫德均可影响脑脊液的T细胞，但只有那他珠单抗治疗与进行性多灶性脑白质病变（progressive multifocal leukoencephalopathy，PML）的高风险相关。

PML是CNS的一种机会性的病毒感染；免疫细胞成分和表型的何种改变易引起PML，是目前研究的一个重点领域。脑脊液中仅有CD4+T细胞减少殆尽，可能并不足以增加PML的风险。

利妥昔，为抗CD-20抗体，可致脑脊液B细胞剧烈减少，但鞘内IgG合成仅轻度改变。抗体的生成受到CD20-细胞的限制，但该细胞并非利妥昔的靶点。因此，稳定的IgG水平提示鞘内IgG主要由长寿命浆细胞所产生，而非短寿命的浆母细胞（必须由CD20+细胞再生）产生。

但另一项研究认为，IgG的合成与脑脊液中浆母细胞的数量而非浆细胞的数量更为相关。需要注意的是，利妥昔单抗亦可减少脑脊液中的T细胞，这可能为B细胞剧烈减少的继发作用；B细胞可通过产生细胞因子和抗原呈递作用影响T细胞。

表8.  MS治疗对白细胞亚群的作用 

四、讨论

采用流式细胞技术分析脑脊液已成为临床常规检查，有助于研究MS的病理生理学机制；目前普遍认为白细胞的迁移，尤其是记忆性T细胞向CNS的迁移，是MS重要的早期改变。

白细胞从血液向CNS的迁移经由三条途经：从脉络丛进入脑室脑脊液中，从脑膜血管进入蛛网膜下腔，以及从实质血管进入CNS脑实质中（图）；其中第三条途经在生理状态下很少存在，但炎症、血脑屏障被破坏时可导致白细胞向CNS渗入增多。虽然脑脊液和脑实质直接的细胞交换机制尚不完全清楚，但脑脊液和外周血中T细胞和B细胞的关系支持该假设。

在CNS内，自体反应性T细胞可被抗原呈递细胞反应性激活。MS早期，树突状细胞在脑脊液内聚集，随着病程的延长而数量逐渐减少，提示其在疾病的始动中具有重要作用。随后，树突状细胞的作用减弱，记忆性T细胞的大量增生维持着慢性免疫反应。调节性T细胞的功能缺损可能损害了机体对髓鞘抗原的耐受。

此外，CNS内B细胞的募集可产生抗体生成细胞，促使疾病向非抗体依赖性的过程进展（如抗原呈递和细胞因子的分泌）。异位淋巴组织可能为自体反应性B细胞的慢性增殖提供了微环境，同时异位淋巴组织也是其它自体免疫疾病的靶器官。

尽管我们已对MS脑脊液细胞的免疫表型有了一些了解，但在其病理生理的作用还存在理解的局限。白细胞向CNS迁移的不同途径可能与CNS自体免疫并不相关；因此脑脊液的细胞成分与炎症组织内的细胞成分并不相同。譬如，脑脊液中以CD4+T细胞为主，但脑实质内淋巴细胞的浸润以CD8+T细胞为主。腰椎穿刺取得的脑脊液标本与脑室内脑脊液可能也不相同。

此外，确定MS的特异性病变（其它神经炎性疾病中不存在）仍是一项艰巨的挑战。MS脑脊液中可见的丰富的细胞亚群（如IL-17分泌型γδ T 细胞和CCR2+CCR5+T细胞），在其它炎性CNS疾病中缺如；但对于这些研究数据的解释必须小心谨慎，因为其它炎性CNS疾病的病理各异。

如有纵向研究数据，则可促进脑脊液分析的特异性。脑脊液中浆母细胞的持续性增多是MS的典型性发现，该现象在神经炎症性病变中罕见。但由于难以重复进行腰椎穿刺，因此脑脊液的研究缺乏这样的纵向数据。单次的脑脊液标本只能反映出免疫反应大量动态变化的一个瞬间。

脑脊液分析在未来的作用如何？尽管有着上述的局限性，但脑脊液细胞免疫表型的分析还是具有诊断价值的，可以评估不同疾病的异质性，作出个体化的预后评价，优化治疗决策。

在目前为止，尚无MS的细胞标记物可满足临床实践的需要。完全理解脑脊液的生物标记物，需要进行大规模的前瞻性、多中心的对照研究，各研究中心之间需要采用标准化的标本采集方法和程序。对照组的定义也很重要，因为很难采集到严格意义上的健康参与者的脑脊液。MRI检查也有助于确定脑脊液标记物的价值。

为满足这些研究质量的标准，我们建议脑脊液细胞分析应该采用临床试验完成；这样才最能确定可预测病程、治疗效果和副作用（如PML）风险的、可靠的生物标记物。

从这样的临床试验中获得的信息，有助于我们预测不同治疗方案的成功率和风险，为治疗的决策提供基石。现在FDA批准的MS的治疗药物日益增多，因此需要建立一个选择最佳药物、为患者进行个体化治疗的新决策模型。

在未来，临床试验和MRI影像研究可为MS患者寻找出个体化的免疫标记物；如果我们能找到有效的脑脊液标记物，则可大大改进MS这一异质性疾病的治疗效果。